Nature发表基于选择性非同源末端连接修复的基因治疗方法

　　近年来，由核酸酶介导的靶向基因组编辑技术发展迅速，CRISPR/Cas9基因编辑系统以其简便性、高效性等特点而备受关注。CRISPR/Cas9系统对致病基因突变进行纠正通常是利用DNA同源重组修复来实现的，该过程需要同时提供一个外源DNA作为供体以重新编码DNA序列达到基因编辑的目的。但伴随而来的，有诸如低切除频率和潜在的序列重新整合等问题【1】。

　　DNA双链断裂（Double-strand breaks, DSBs）的修复通路主要有非同源末端连接修复（Non-homologous end-joining, NHEJ）和同源重组修复（Homologous recombination, HR）两种。除此之外，还存在不常用的选择性非同源末端连接修复（Microhomology-mediated end joining，MMEJ，也叫Alternative-NHEJ, Alt-NHEJ），它主要利用损伤区域的微同源片段（2-25 bp）发生退火反应，切除非同源ssDNA（single-strand DNA），最后将断裂的DNA重新连接在一起【2】。MMEJ修复断裂的DNA常会造成连接处发生微同源片段的缺失甚至导致基因重排，因此是一种易错的修复方式。研究表明，MMEJ途径存在于植物、细菌、人类等多种类型细胞中，同时MMEJ途径也被应用在对哺乳动物细胞、斑马鱼和青蛙胚胎中定向插入外源性供体DNA的研究中【3-5】。那么，基于HR途径进行的基因编辑所带来的困难能否通过利用MMEJ途径得到改善？

　　2019年4月4日，来自于美国马萨诸塞大学医学院的Scot A. Wolfe团队和Charles P. Emerson Jr团队合作在Nature在线发表了一篇题为Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break的文章，描述了一种简单有效的基因纠正疗法，即利用Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）核酸酶系统对基因组上致病性微重复中心附近区域通过MMEJ通路进行修复编辑，以实现精准回复野生型基因序列的目的。

　　在本文中，研究人员选择了两种均为常染色体隐性遗传但是由不同长度的致病性微重复造成的疾病模型：肢带型肌营养不良2G型( limb-girdle muscular dystrophy type 2G, LGMD2G)和白化病亚型Hermansky-Pudlak综合征1型(Hermansky–Pudlak syndrome type 1, HPS1)，设计试验以评估基于MMEJ的修正方式的有效性【6,7】。

　　在LGMD2G患者东亚人群中，存在一种疾病等位基因TCAP突变，其1号外显子中存在着8-bp的微重复序列，突变频率为1/1000。正常情况下其编码TCAP蛋白（Telethonin），绑定于肌联蛋白Z1-Z2区，在调节肌原纤维的组装中起到重要作用。研究表明，在青春期晚期到成年早期易发TCAP的纯合或者杂合突变从而导致个体严重的肌肉萎缩和心肌病。研究人员获得了来源于LGMD2G病人TCAP微重复纯合突变的iPS细胞，针对TCAP上8-bp微重复，研究人员设计了靶向sgRNA以期产生避开微重复中心的一个碱基对断裂（图1）。

图1 致病性8-bp微重复TCAP(粗体红色和蓝色文本)。红色框内为SpCas9 PAM序列，下划线为前间隔序列.红色箭头表明诱导DSB的位点，半红半蓝文本为修复后的野生型序列

　　通过电穿孔方式将纯化的SpCas9与sgRNA(RNP)复合体导入iPS细胞内。深度测序分析结果表明基因组特定区域上发生了大约80%的indel（insertions and deletions），表明SpCas9 RNP能有效的在设计位点产生双链断裂。对序列变异样本进一步的分析表明平均约有57%的等位基因包含了与野生型等位基因相同的精确的8-bp 删除后的序列。此外，SpCas9 RNPs不会对TCAP等位基因造成可测量的过度编辑，这也表明突变细胞中经过修正的等位基因不会因为意外的损伤而导致MMEJ修复逆转。22株经核酸酶处理的LGMD2G iPS细胞克隆基因型鉴定结果表明77%的iPS细胞含有至少一个野生型等位基因，说明大部分经处理的细胞实现了基因纠正。对iPS来源的成肌细胞进行同样的试验，约45%的等位基因可以被精确的纠正为野生型序列。对两种细胞体外基因纠正试验的成功为通过在微重复中合适的区域引入一个DSB进行精确修复在体内的治疗提供可能。

　　同样的，研究人员对HPS1疾病模型也进行了体外验证实验。HPS1患者其基因第15个外显子上存在着16-bp的致病性微重复。HPS蛋白参与溶酶体相关的细胞器复合物的生物发生过程，HPS1突变病人患有白血病、失血症、进行性肺纤维化等疾病，从而导致过早死亡。研究人员获得了患者来源的16-bp微重复纯合突变B淋巴细胞系（B-LCL），利用SpCas9 RNPs系统对特定区域进行两个碱基对切除，发现同样也存在一定比例的突变等位基因回复。同时，对微重复区域上的靶向切割位点的选择和可选择性微同源区域的存在会影响预期的正常回复产物的产生。

　　紧接着，研究人员发现抑制DNA修复因子PARP-1会降低MMEJ的修复效率，说明MMEJ通路是LGMD2G和HPS1模型中单个靶向DSB产生后对微重复进行稳定校正的基础（图2）。

图2. 两种DNA DSB修复途径示意图

　　DSB产生的不同DNA双链末端决定了不同的修复途径。NHEJ通路是大多数细胞中占主导地位的DSB修复通路。MMEJ通路通过末端切除来发现断裂两侧的微小同源序列，这些同源序列可用于模板化断裂端融合。PARP-1可通过MMEJ通路调控DSB修复。用PARP-1抑制剂rucaparib治疗细胞可降低DSB在MMEJ修复通路中的通量。

　　最后，研究人员证明了无论是利用Cas9体系抑或是Cas12a体系，基于MMEJ的编辑方法可以有效的应用于长度达到至少36-bp的微重复区域的靶向编辑。

　　总的来说，本项研究通过大数据分析和生物学实验结合的手段阐述了针对致病性微重复突变引发的疾病，通过MMEJ途径进行精确修复是一种很好的替代同源重组定向修复的方法。随着人类基因组和表型研究数据的不断积累，利用大数据分析或许可以发现能够通过基于MMEJ方式进行基因编辑纠正的新型致病性微重复。虽然该方式潜在的机制以及是否存在该方式特异性治疗的细胞尚未明确。但是本项研究为寻求基于MMEJ对例如LGMD2G，HPS1以及其他由微重复造成的疾病的治疗方法奠定了基础。

　　原文链接：

　　https://doi.org/10.1038/s41586-019-1076-8

　　参考文献

　　1. van Overbeek, M. et al. DNA repair profiling reveals nonrandom outcomes at Cas9-mediated breaks. Mol. Cell .63, 633–646 (2016).

　　2. Bae, S., Kweon, J., Kim, H. S. & Kim, J.-S. Microhomology-based choice of Cas9 nuclease target sites. Nat. Methods 11, 705–706 (2014).

　　3. Kim, S.-I. et al. Microhomology-assisted scarless genome editing in human iPSCs. Nat. Commun. 9, 939 (2018).

　　4. Hisano, Y. et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci. Rep. 5, 8841 (2015).

　　5. Sakuma, T., Nakade, S., Sakane, Y., Suzuki, K. T. & Yamamoto, T. MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR–Cas9 with the PITCh systems. Nat. Protoc. 11, 118–133 (2016).

　　6. Moreira, E. S. et al. Limb-girdle muscular dystrophy type 2G is caused by mutations in the gene encoding the sarcomeric protein telethonin. Nat. Genet. 24, 163–166 (2000).

　　7. El-Chemaly, S. & Young, L. R. Hermansky–Pudlak syndrome. Clin. Chest Med. 37, 505–511 (2016).