Nature子刊|碱基编辑器新拓展

作为Cas9核酸酶的进化祖先，IscB蛋白作为紧凑RNA引导的DNA内切酶和缺口酶，使其成为碱基编辑的强有力候选者。然而，目标范围狭窄限制了IscB系统的应用;因此，有必要找到更多识别不同靶邻基序(TAMs)的IscB。

2024年8月15日，辉大基因张海南、李彤、复旦大学黄锦海、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉共同通讯在Nature Chemical Biology（IF=13）在线发表题为”Engineered IscB–ωRNA system with expanded target range for base editing“的研究论文，该研究开发的工程IscB -ωRNA系统能够扩展目标范围的碱基编辑。

在这里，研究人员从未培养的微生物中鉴定出19种未表征的IscB蛋白中的10种，这些蛋白在哺乳动物细胞中具有活性。通过蛋白质和ωRNA工程，进一步增强了其同源物IscB的活性。并将其TAM范围从MRNRAA扩展到NNNGNA，产生名为IscB.m16*的变体。通过将脱氨酶结构域与IscB融合。m16* nickase，生成IscB。m16*衍生的碱基编辑器在哺乳动物细胞中表现出强大的碱基编辑效率，并通过单次腺相关病毒传递有效地恢复患病小鼠的杜氏肌营养不良蛋白。因此，该研究为基础研究和治疗应用建立了一套紧凑的碱基编辑工具。

CRIPSR-Cas系统，如II型Cas9和V型Cas12系统，作为针对病毒的原核适应性免疫系统，已发展成为基础研究和基因治疗中的基因组编辑工具。工程Cas9缺口酶(nCas9)或失活Cas9 (dCas9)版本融合了各种结构域，已经建立了碱基编辑、引物编辑和表观基因组编辑技术。然而，Cas9和Cas12的大容量，特别是基于nCas9的基因编辑工具，阻碍了基于腺相关病毒(AAV)载体的基因编辑的应用。目前已经报道了紧凑的Cas9、Cas12f同源基因(400 - 700 aa)和Cas12的祖先分支TnpB(~400 aa)。然而，由于它们的编辑活性差或缺乏HNH结构域，这些蛋白质的碱基编辑活性有限。

IscB蛋白编码在具有HNH和RuvC结构域的IS200/IS605转座子家族中，如Cas9，并且被认为是Cas9的祖先。然而，IscB蛋白的大小仅为Cas9的五分之二(~ 400aa)。最近的研究表明，IscB系统(IscB -ωRNA)是一种可编程的长链非编码RNA (ωRNA)引导的DNA核酸内切酶，基于ogeuiscb的工程碱基编辑器(enOgeuIscB-BEs)在哺乳动物细胞中具有较高的碱基编辑效率。IscB系统需要一个3 '端靶向邻近基序(TAM)来识别目标DNA(通常为6 nt)，而最近报道的enOgeuIscB需要4 nt (NWRRNA)。复杂的TAM序列大大减少了可编辑的位点数量。OgeuIscB在哺乳动物细胞中的TAM范围较窄，已成为其明显的局限性。因此，有必要开发效率更高、TAM范围更广的微型碱基编辑器。

功能性IscB同源物的鉴定与表征（图源自Nature Chemical Biology）

在这里，作者从宏基因组数据集中鉴定了19个具有不同TAM范围的天然IscB -ωRNA系统。通过设计ωRNA和IscB。m16蛋白，生成了IscB。m16*系统(IscB)m16含有E326R、T459E、P460S、T462H取代(IscB.m16RESH)和ω RNA)，具有较强的编辑活性，并将TAM范围扩大到哺乳动物细胞中的NNNGNA。进一步发展了IscB。基于M16 *的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器在哺乳动物细胞和小鼠模型中显示出强大的碱基编辑效率和广泛的靶标识别。此外，还提供了具有不同TAM范围的IscB -ωRNA系统的综合数据集和扩大TAM范围的策略。总体而言，工程紧凑型IscB衍生碱基编辑器已被证明是在哺乳动物细胞和疾病小鼠模型中高效、特异性和宽范围DNA碱基编辑的平台，突出了它们在基因治疗中的潜力。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41589-024-01706-1