Nature重大进展！联合企业，共同突破基因药物递送瓶颈！

　　最近，单链反义寡核苷酸（ASO）已被广泛研究用于治疗中枢神经系统疾病。SPINRAZA 被批准用于治疗脊髓性肌萎缩症，是一种单链 ASO，可调节 SMN2 前体 mRNA 的剪接。单链 ASO 在全身给药后不进入 CNS，而是通过鞘内注射直接给药到脑脊液中。SPINRAZA 的经验表明，大多数个体对鞘内给药的耐受性良好。然而，鞘内注射比静脉内 (i.v.) 注射更具侵入性，对于患有严重腰椎侧弯的个体或与抗凝治疗联合使用可能会很困难。因此，将 ASO 从血液输送到大脑的有效方法将是有利的。

　　全身注射后用于调节中枢神经系统基因表达的寡核苷酸类药物必须能够跨越强大的血管屏障，包括血脑屏障和血液-脑脊液屏障。通常，只有分子量<450 Da的疏水小分子才能穿透这些屏障。最近的几种将寡核苷酸导入中枢神经系统的策略没有显示出有效的RNA降解。之前报道了一种DNA/RNA异源双链寡核苷酸(HDO)技术，该技术通过静脉注射在小鼠和非人灵长类动物的肝脏中实现有效的RNA降解。然而，传递到大脑仍然是微不足道的。

　　鉴于此，东京医科齿科大学Takanori Yokota联合武田制药公司、美国Ionis制药公司的研究人员表明，在RNA链5′端与胆固醇或α-生育酚结合的DNA/RNA异源双链寡核苷酸药物可以通过静脉或皮下给药有效地穿过血脑屏障。成果发表在Nature Biotechnology上。

　　研究人员合成并评估了14种亲脂质性结合物，包括9种天然脂肪酸和甾醇，用于小鼠中枢神经系统的基因敲除。将靶向非编码RNA转移相关肺腺癌1（Malat1）的全硫代磷酸酯（PS）修饰的锁定核酸（LNA）/DNA gapmer与2'-O-甲基糖修饰的 RNA/RNA 互补链形成双链与各种疏水部分结合。

　　在 50 mg kg-1 的剂量下，通过qRT-PCR测量大脑皮层中的 Malat1 RNA 水平。单链 ASO 没有观察到 Malat1 的敲低，这与之前的研究结果一致，即单链 ASO 在全身注射后确实渗透到 CNS 中。长链脂肪酸结合物，如月桂酰 (C12)、月桂酰 (C12OH)、硬脂酰 (C18) 和 α-生育酚，在 CNS 中表现出适度的 Malat1 抑制，但胆固醇结合物是最有效的，单次静脉注射可将Malat1水平降低约60%。此外，与单链ASO结合物相比，加上HDO的设计也有助于向中枢神经系统传递。

　　研究人员还进行了一项剂量反应研究，两种 Chol-HDO 在皮质和脊髓中都显示出剂量依赖性的靶基因敲低。大脑皮层和脊髓中 RNA 表达的减少在第 7-14 天达到最大。Chol-HDO 的 RNA 减少在整个大脑中持续了 2 个月以上。

　　与其他治疗方式相比，ASOs 的代谢稳定性在 CNS 中是长期存在的，这表明可以通过重复给药来提高 ASOs 的组织浓度来改善寡核苷酸的递送策略。即重复注射 Chol-HDO 会产生 RNA 减少效果的简单总和。HDOs 分布在整个大脑、脊髓和外周组织中，并在 CNS 中抑制四种靶基因的表达高达 90%。在主要的中枢神经系统细胞类型中观察到基因敲低，在神经元和小胶质细胞中最为明显。

　　研究人员还比较了全身 Chol-HDO 递送与单链 ASO 直接脑室内 (i.c.v.) 推注给药的效率，这是目前鞘内给药疗法临床前开发的策略。研究人员发现全身给药的 Chol-HDO 和 i.c.v. 给药的 ASO 的 EC50 值相似。将这些结果与 i.c.v. 给药的 Chol-HDO 和 ASO 获得的 ED50 值进行比较表明，直接 i.c.v. 注射需要较低的剂量才能在中枢神经系统中实现相同水平的敲低。这可以设想一种联合策略，即使用鞘内注射快速达到中枢神经系统中ASO的治疗浓度，然后对需要终身治疗的个体进行静脉注射或皮下注射Chol HDO的维持治疗。

　　在治疗主要局限于中枢神经系统的疾病时，该技术的一个潜在安全性问题是，Chol HDO的生物分布在外周组织中远远大于在大脑中，从而导致潜在的不良副作用。然而，尽管用Chol-HDO观察CNS靶基因敲除所需的剂量较高，而且即使在外周器官（如肝脏和肾脏）中观察到ASO相对于CNS有较高的积累，但该化合物通常具有良好的耐受性。这种在外周器官中的分布特征是未结合和脂质结合的 ASO 和短干扰 RNA (siRNA) 的典型特征。

　　综上所述，胆固醇 HDO 设计在抑制 CNS 中的基因表达方面最有效。相比之下，Chol-ASO 和 Chol-siRNA 在全身给药后在 CNS 中不显示活性。这表明 ASO 从血液输送到 CNS 需要胆固醇和特定的双链寡核苷酸结构的组合。事实上，具有环状结构框架的胆固醇和生育酚都比直链脂肪酸更有效，这表明特定脂质结构的优势。

　　参考文献：

　　Nagata, T., Dwyer, C.A., Yoshida-Tanaka, K. et al. Cholesterol-functionalized DNA/RNA heteroduplexes cross the blood–brain barrier and knock down genes in the rodent CNS. Nat Biotechnol (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-00972-x