实验概要
本实验参照Sambrook等(1989)的方法进行转膜，杂交。
实验步骤
1. RNA样品的电泳转膜
将适量的琼脂糖溶于水，微波炉加热使之完全溶解，并冷却至60℃；将甲醛溶液、琼脂糖水溶液、5X甲醛凝胶电泳缓冲液按1:3.5:1.1比例混合，灌制凝胶。将不同材料的上样量调成一致，均为35ug，与样品buffer混合制样，65℃温育15min，冰浴冷却后，加入loading buffer上样。DEPC水浸泡过的电泳槽中，加入1X甲醛凝胶电泳缓冲液((5X甲醛凝胶电泳缓冲液：MOPS 10.3g；乙酸钠2.72g；EDTA(0.5M pH8.0)5ml；ddH2O加至500mI；pH 7.0)，3-4v/cm电泳。待溴酚蓝迁移至凝胶的2/3处，停止电泳。
将凝胶转移至一个培养皿内，切去凝胶左上角以作标记；将凝胶用灭菌的DEPC水淋洗3-4次，然后浸泡于数倍体积的20 X SSC温和摇动45min；利用毛细作用转膜(转移缓冲液为20XSSC)，转移18小时；120℃烤膜30分钟。
样品buffer：5 X甲醛凝胶电泳缓冲液2.0ul；甲醛3.5ul；甲酰10.0ul
10 X loading buffer：0.5M EDTA (pH8.0) 2ul；甘油500ul；溴酚蓝250mg；二甲苯青FF 250mg；ddH2O加至lml。
2. 杂交、压片
放射性药品操作完全按照放射安全防护守则进行。
将结合有RNA的尼龙膜先用6 X SSC完全浸湿，然后再放入杂交管中，加入适量预杂液，65℃预杂交2-3hr；标记好的探针，利用PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN )加以纯化，100℃煮沸变性，l0min；预杂交结束后，加入适量杂交液和纯化的、变性的探针，65℃杂交过夜(17小时以上)；用不同浓度的洗脱液65℃洗脱，一般先用低严谨洗脱液，再用高严谨洗脱液，根据实际情况确定洗脱时间。其间，用放射性检测仪检查硝酸纤维素膜上放射性杂交信号的强弱。用保鲜膜包裹尼龙膜后，在暗室中，用X-光胶片进行放射自显影；-80℃曝光3-7天后，按常规洗片。
预杂液：20 X SSC 15ml；50 X denhardt 5ml；10%CDS 2.5ml；鲑精DNA (Sigma) (l0mg/ml) 0.5mI；ddH2O 27ml
杂交液：20X SSC15ml；10%SDS 2.5ml；鲑精DNA(Sigma) (l0mg/ml) 0.5mI；ddH2O 32ml
洗脱液：2 X SSC加0.1%SDS；1 X SSC加0.1%SDS；0.1 X SSC加0.1%SDS
