PCR基因扩增2

（4）引物的熔点温度（Tm值）要适当。Tm值与引物的碱基组成和长度有关；PCR引物的GC/AT应与要扩增的模板DNA相当或略高些。一般熔点温度以大于55℃为宜。

（5）引物的3，末端必须与模板严格互补，而5，末端的要求可灵活些。

（6）目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。

（7）用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性内切酶位点。为了保证内切酶有效酶切扩增产物，一般在酶切位点的5，端再加上几个额外的碱基。

（8）引物的浓度，在终浓度为0.2～1.0 umol/L的范围内产量基本相同，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。

3. 热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

一般用量为2.5 U/100uL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。该类酶的最适温度为75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物-模板的非特异延伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。

4. dNTPs

PCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种dNTPs应等当量。浓度

低则反应速度下降，过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的dNTP浓度。

5. PCR缓冲液

因PCR反应中的dNTP能与Mg2+结合，影响反应液中游离Mg2+的浓度，所以应按不同条件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的PCR反应中（dNTP浓度200umol/L），Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响PCR的产量及产物特异性。浓度高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及5mmol的二硫苏糖醇（DTT）对酶有一定的保护作用。

6. PCR循环的温度

预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为94℃ 3-5min。变性不完全时，DNA双链会很快复性，影响PCR反应，但若变性温度太高（不宜超过95℃），会影响Taq酶的活性。

变性：一般为94℃ 30s或95℃ 20s。

引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定。一般为50-72℃。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物3，端不正确核苷酸的错误延伸。

延伸：一般为72℃ 60-90s。最后一个循环后应在72℃保留5min，以保证PCR产物合成的完整性。

7．平台效应和PCR循环的次数

在PCR基因扩增的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲线，即所谓平台效应。它的出现是由于PCR原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产物的阻滞效应及非特异性产物等多种因素造成的，所以选择合理的循环次数，既能得到足够量的PCR产物，又不要无意义地增加循环次数。

8. 操作环境

避免环境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目标DNA的污染等。