PCR基因芯片上荧光PCR反应的研究（一）

郝麟1）  朱平1）＊  于晓梅2）  张大成2）  赵新生3）   欧阳贱华3

（1）北京大学第一医院 北京 100034； 2）北京大学微电子学研究所 北京100871； 3）北京大学化学与分子工程学院    北京100871）

目的:
我们设计一种含有大量微反应池的PCR基因芯片，能对基因的重排，突变和缺失等基因变异进行检测。PCR基因芯片的关键问题是如何检测出来在微反应池内获得的极其微量PCR产物。本文应用一些临床病例的实例标本，观察能否在基因芯片上进行不同的荧光掺入PCR反应并根据基因芯片上荧光的变化判断基因的变异。

方法：制作以硅片为材料的PCR基因芯片。利用健康外周血，正常脐血DNA，X连锁遗传性铁粒幼细胞贫（XLSA）家系成员6人外周血DNA做PCR-SSCP，并测序确定。设计检测此点突变的Taqman探针进行荧光PCR反应，在芯片上进行同样的反应，与上述反应结果进行对照。利用4步位点特异PCR结合SYBR荧光染料初筛HLAA2，并在芯片上进行同样的反应，与上述反应结果进行对照。

结果：设计并制作了有192个微反应池以硅片为材料的PCR基因芯片。PCR-SSCP分析与测序确定X连锁遗传性铁幼粒细胞贫血家系两患者的ALAS2基因第5外显子有G514A点突变，母亲、外祖母为杂合子携带者。设计Taqman探针对此家系中六位成员DNA与二份正常男性脐血DNA检测与预期结果相符。将上述结果中同样的样本移入芯片进行PCR反应，结果与常规荧光PCR反应的结果一致。SYBR荧光染料PCR反应与芯片上SYBR荧光染料PCR反应的结果与预期完全相符。

结论：利用TaqMan探针与SYBR
Green荧光染料可以在PCR基因芯片上顺利进行PCR反应，根据基因芯片上荧光的变化检测出点突变与单核苷酸多态性。为基因芯片的临床应用打下了基础。

关键词： PCR基因芯片；荧光PCR反应；Taqman探针；荧光染料；

基因芯片技术具有快速多样、微型化和自动化[1～4]等特点在生物医学领域广泛的应用。但由于其基本原理是基于核酸杂交技术，有着内在的缺陷[5-6]，实验的敏感性和重复性都存在一定问题。核酸杂交较适合于检测基因的表达，不易检测基因组DNA的基因的重排，突变和缺失。而大多数肿瘤性疾病和一些遗传变异和表型的改变与后者有关。为了解决上述问题，我们将芯片技术与荧光PCR技术相结合，设立设计一种含有大量微反应池的PCR基因芯片，以期能快速、准确的对基因的重排，突变和缺失等基因变异进行检测。常规PCR反应产物的检测是电泳后观察获得基因片段的大小，PCR基因芯片的关键问题是如何检测出来在微反应池内获得的极其微量PCR产物。本文应用一些临床病例的实例标本，观察能否在基因芯片上进行不同的荧光PCR反应，如何根据基因芯片上荧光的变化判断基因的变异。

1 病例、材料与方法
 
1.1  基因组DNA标本
健康成年人外周血DNA，正常脐血DNA，X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血（XLSA）家系成员6人外周血DNA均获自北京大学第一医院，均签署知情同意书。XLSA家系中患者为兄弟两个，年龄分别为8、7岁，都在婴儿时即发现贫血。家中有一个健康的姐姐，在两兄弟出生前，母亲曾有多次男胎自然流产史。成熟红细胞形态呈典型的小细胞低色素性贫血，骨髓铁染色可见大量环形铁粒幼细胞。临床初步诊断遗传性铁粒幼细胞贫血。

1.2  PCR基因芯片的设计与制作［7］
PCR基因芯片上制备大量微反应室，可以同时进行不同的PCR反应。采用单抛525mm厚硅片作为衬底材料。硅片常规清洗后，在10-50°C下生长800nm厚的湿氧热氧化层，作为第一层掩膜层。然后150nm厚的Si3N4低压化学气相淀积（LPCVD）在硅片表面，形成第二层掩膜。第一次光刻，RIE刻蚀反应室及其流道上的Si3N4；采用掩膜板2光刻反应室的图形，RIE和BHF刻蚀反应室表面的SiO2。KOH腐蚀反应室的硅至150 um，此时流道上的硅由于有足够厚的SiO2作为保护层，没有开始腐蚀。腐蚀掉流道上的SiO2，同时进行反应室及流道上继续SiO2的腐蚀，KOH腐蚀的速度为1um／min，芯片进行热氧化生长300 um SiO2，以增强其表面的亲水性，保证反应液可以在芯片内顺利流动。芯片通过PVC聚合物压合封闭。

1.3  PCR基因芯片上应用Taqman荧光探针
1.3.1 PCR扩增XLSA家系ALAS2基因第五外显子并且获得基因片段
经www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST查询ALAS2基因的全长序列。应用Primer3.0软件设计第五外显子引物：上游引物: 5’-ccataagtcaatgactgagc-3’，下游引物: 5’-aagtggtgatagaacccaag-3’。在94℃ 3分钟，然后94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 1分钟共30个循环，72℃ 延伸5分钟条件下进行PCR反应。取0.5EP管，加入7ulPCR产物及3ulSSCP上样缓冲液，96℃变性10分钟。10％SSCP－聚丙酰胺凝胶及银染色。PCR 产物交上海博亚公司直接测序。