PCRArray简单实用的检测基因表达的高通量方法

简介：什么是PCR芯片？

实时定量PCR是检测基因表达最灵敏，最可靠的方法。通过在试验过程中，实时监测荧光染料的信号变化，反映样品中的基因拷贝数。实时定量PCR线性范围广（能达到5个数量级），因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。但是，由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因，因此，每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。

通过简单的，经过优化的实时定量PCR体系，如SuperArray的RT2ProfilerTM PCR芯片，研究者可以同时研究大量基因，既可以进行某些特别感兴趣的信号通路的研究，也可以作为验证芯片结果的方法。

为了获得理想的实验结果，PCR芯片面临以下挑战：高特异性，高灵敏度和可重复性。高灵敏度或低检出限，在样品的总RNA量少，基因表达量低的情况下，也能检测出目的基因。高特异性，扩增产物严格保证基因特异性，避免非特异性产物，如引物二聚体的产生。可重复性，通过标准化的反应体系和实验方法，使得多人多次重复实验均能获得可靠的基因定量结果。

PCR芯片实验操作步骤

采用PCR芯片进行实验只需2小时。PCR芯片实验过程如图1所示：首先将RNA样品反转录为cDNA第一链，作为PCR模板；接着，将模板加入到反应体系（RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix）中。在已经固定好基因特异性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反应体系，进行PCR反应。采用仪器配套的软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值（Ct）。最后，采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。通过分析看家基因Ct值的一致性，可确定合适的标准化方法。芯片所设置的对照，可以检测PCR体系中是否存在DNA污染，或者是否有影响反转录或PCR实验步骤的因素存在。
 

图一 PCR芯片实验流程

PCR芯片的设计和所包含的基因

96孔模式的每种RT2Profiler PCR芯片，含有基因特异性引物，可用于研究84个与某种信号通路或者疾病相关的基因。此外，芯片中还有设置了3个检测实验质量的对照。图2为PCR芯片模式图。由于每种芯片都是根据特别的信号通路或者特定的应用范围设计的，研究者可以用它来研究自己感兴趣的一组基因，一个生物学通路或者某种疾病状态。PCR芯片所研究的基因范围相对集中，大大节省了在数据分析方面所花费的时间，相对更简洁针对性更强的信息也有利于接下来的更深入更准确的研究。因此，研究者使用PCR芯片，可以在更短的时间内得到更丰富的信息。此外，Superarray将相关基因设计在同一张PCR芯片内，为实验准备阶段也提供了方便。