PCRSSCP技术检测细菌

长期以来，临床上主要用细菌培养和血清学方法检测病原菌，但均不能达到快速诊断细菌感染的目的。常规PCR技术采用针对特定病原菌的特异性引物，由于临床病原菌往往不明，需用多种不同引物和扩增程序进行PCR扩增，亦难实现快速诊断。PCR-SSCP技术主要用于基因突变的检测，利用该技术鉴定细菌虽有报道[1，2，3]，但都限于临床菌株，未与标准菌株为对照。本研究采用细菌共有的16SrRNA基因的保守区引物作为通用物。对几种常见的细菌进行PCR扩增，SSCP分析PCR产物，并以标准菌株为对照，旨在达到快速检测不同细菌的目的。

1. 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：

　　大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)由中国药品生物制品检定所提供。温州医学院附属二院检验科分离保存的临床株—肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌、洛菲不动杆菌。

1.1.2 引物：

　　引物设计参照文献_[3]进行，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，经鉴定为电泳纯。

1.1.3 主要仪器和试剂：

　　Beckman GS—15R离心机，Perkin Elmer ?DNA扩增仪，DYY—Ⅲ型稳压电泳仪为北京六一仪器厂产品，Taq DNA聚合酶、dNTPs、100bp DNA? Ladder对照购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA制备：

　　DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，主要步骤如下：菌株于血平板上37℃培养过夜，挑取0.5cm大小的菌落悬浮于200μl ?TE中，再加入400μl裂解液、3μl蛋白酶K混匀，55℃水浴1小时。加入600μl氯仿混匀，10000转／分离心2min。取500μl上层清夜移至1.5ml离心管中，加入500μl沉淀液混匀，室温放置2min，10000转／分离心2min。吸去上清液，立即加入100μl的1.2mol／L? NaCl，轻轻振荡至DNA样品完全溶解，加入3μl ?RNA酶A，37℃ 10min，再加入300μl预冷的g无水乙醇，-20℃放置10min，10000转/分离心4min。吸走乙醇，用70％乙醇洗一次。倒置室温干燥10min，100μl? TE溶解DNA。
1.2.2? PCR扩增：扩增体积50μl：10×buffer(包括Mgcl2)5μl ，20mmol／L dNTPs 1μl ，5U／μl Taq酶0.2μl，5μl模板DNA，各引物2.5μl，无菌去离子水补足体积。扩增条件：94℃1min，56℃1min，72℃30s，扩增30个循环。
1.2.3? SSCP分析：取5μl PCR产物，与等量变性上样缓冲液(5mmol／LEDTA(PH8.0)，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯氰，95％甲酰胺)混匀，99℃热变性10min后，迅速置冰水浴中不停振荡10min，10μl处理产物全部上样，干预电泳1小时的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(电泳槽置于4℃冰箱中)。电泳条件 ：1×TBE,4℃，16mA4h。

1.2.4 银染：

　　凝胶10％乙醇固定10分钟，1％硝酸作用4min，水洗2次，0.2％硝酸银(新鲜配制)染20min，水洗3次，3％碳酸钠显色10min，最后用10％醋酸终止反应。

2. 结果

2.1 一对引物P11P—P13P扩增产物SSCP结果(见图1)：

　　洛菲不动杆菌、金黄色葡萄球菌SSCP图谱呈多态性，与其他细菌可相互区别；另外5种细菌SSCP图谱无多态性，较难区别。

2．2两对引物(P11P-P13P，ER10-ER11)扩增产物SSCP结果(见图2)：

　　细菌的SSCP图游呈多态性，单链条带区条带数目、相对迁移率及条带之间的间距存在明显差异，各细菌之间可相互区别。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的标准菌株与临床菌株的SSCP单链条带区图谱完个一致。

3.讨论

　　16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因中，也存在于衣原体、立克次体等原核生物中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物中。16SrRNA基因高度保守，但其保守性是相对的，在保守区之间存在着9或10个变异区，保守区和可变区互相交错排列，不同细菌都有不同程度的差异，可设计不同引物对所有细菌或特定细菌进行PCR检测[4]。利用PCR技术扩增16SrRNA基因，可早期判断是否存在细菌感染，进—步分析扩增产物鉴定病原菌的种属，弥补了细菌培养和血清学检测的不足。目前主要是将两条引物设计在16SrRNA基因保守区成为通用引物，首先确定是否存在感染，然后在中间的特异区中选择序列做探针进一步鉴定细菌_[4,5]，除了需PCR扩增外，还要进行探针杂交，较为复杂且费用高。李雷等_[6]采用细菌16SrRNA基因通用引物，分别通过半套式PCR和套式PCR对不同细菌的DNA进行扩增，以检测细菌，需要两次扩增，较复杂且增加了污染的机会。另外有学者根据16SrRNA基因设计寡核苷酸引物，再将扩增产物进行DNA测序分析_[7]，序列分析非常特异和准确，但费时且费用高，临床上难以推广。

　　SSCP技术可区分由少至一个碱基的改变而导致的构型改变，主要用于检测基因突变_[8，9]，不同细菌间的16SrRNA基因序列都有不同程度的差异，可采用SSCP进行分析。本实验发现利用一对引物时，有5种细菌的SSCP图谱无多态性，难以相互区别，与文献_[1，2]报道的有差异，这可能与选择的引物序列不同有关。加入两对通用引物后，扩增出16SrRNA基因中的1173—1389bp和103—357bp区域的靶DNA序列，由于这两对引物位于有种属特异性的可变区的两侧，扩增出的PCR产物有种属特异序列，单链DNA的迁移率是序列依赖性的，故各菌的SSCP图谱呈多态性，差异明显，且其差异与亲缘关系成正比，可能是由于亲缘关系越近，16SrRNA基因的同源性越大，造成单链的构象越相似。本实验还发现，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)与金黄色葡萄球菌的标准菌株和临床菌株的图谱也相同，说明该技术难以区别相同细菌的不同耐药性。SSCP图谱中，在单链条带区前面的200-300bp之间的条带为变性不彻底的残留的双链PCR产物。理论上讲，一对引物的单链PCR产物在SSCP电泳时表现两条单链带_[10]。但在本实验发现，一对引物的图谱中有的反而只有一条单链带；加入两对引物后，有的为5条甚至6条单链带。

　　本实验不需要探针，加入两对通用引物，只需一次PCR扩增，整个过程只需十小时左右；同种细菌的标准菌株与临床分离株的SSCP图谱完全相同，若将不同细菌的标准菌株的SSCP图谱存人数据库作为模式图谱，将临床病原菌的SSCP图谱与之比较，可简便、快速、特异、敏感地检测细菌，尤其适用于临床无菌部位如血液、脑脊液的病原菌检测。在实验过程中要注意每一环节都严格无菌操作，避免出现假阳性结果。