RNA修复模板在植物中实现CRISPR／Cpf1同源重组修复

　　借助 CRISPR/Cas 系统介导的 HDR，实现优异等位基因替换和基因定点插入，进而创制农作物新种质，是农作物基因组编辑研究的热点和重要课题之一。但目前这一技术的广泛应用仍十分具有挑战性，主要原因在于：1）CRISPR/Cas系统引起的基因组靶位点DNA序列双链断裂（Double-strand breaks, DSBs）主要通过非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）途径进行修复；2）通过同源重组介导的修复（Homology-directed repair, HDR）途径修复时，无法高效地将足量的修复模板导入植物细胞。因此，在植物细胞内HDR发生频率特别低，这在很大程度上阻碍了利用CRISPR/Cas系统对农作物基因进行精确编辑。此前，有研究表明，在酵母细胞和人的细胞系中，RNA修复模板可介导HDR (Storici et al., Nature, 2007, 447: 338-341； Nowacki et al., Nature, 2008, 451: 153-158； Keskin et al., Nature, 2014, 515: 436-439)。但RNA转录本做为DNA修复模板，用于基因编辑，在植物中实现等位基因精准替换，尚未见国内外相关报道。若在植物中将RNA转录本作为DNA修复模板，则可通过利用合适的启动子，通过体内转录，产生足够多的修复模板，有望解决修复模板不足的问题。

　　2019年3月18日，中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴课题组与美国加州大学圣地亚哥分校和赵云德课题组合作,在Nature Biotechnology杂志在线发表了题为 Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination 的研究论文。该研究证实了在植物细胞中，RNA转录本可作为修复模板介导DNA同源重组修复；然后利用转录本RNA作为修复模板，借助于核酶（Ribozyme）自切割和 CRISPR/Cpf1 系统既切割DNA又切割RNA的特性，通过同源重组修复方式，实现了水稻乙酰乳酸合成酶（OsALS）的等位基因替换，建立了RNA转录本作为修复模板介导的DNA同源重组修复体系。

　　该研究首先将修复模板体外转录后，分别进行 DNase I、 RNase H 和 RNase A 处理，然后在体外将LbCpf1蛋白与转录的 crRNAs 及RNA修复模板组装为RNP复合体(Ribonucleoprotein Complex, RNP)。基因枪转化水稻愈伤后，通过微滴数字PCR (Digital Droplet PCR, ddPCR) 对重组事件进行评估。实验结果表明，RNA 可作为修复模板参与 CRISPR/Cpf1 介导的DNA同源重组修复。

　　此后，采用两种方法构建同源重组载体：RDR 和 TDT。在 RDR 方法中，将 crRNA 和修复模板片段（Donor repair template, DRT）置于 HH 及 HDV 核酶之间，分别称之为RCR (Ribozyme-crRNA-Ribozyme, RCR)和RDR (Ribozyme-DRT-Ribozyme, RDR) 单元。将RCR1、RCR2和RDR置于OsU3启动子与Nos终止子之间，在转录产物中，由于HH及HDV核酶的自切割作用，crRNAs和修复模板被完整释放。在TDT方法中，修复模板两侧分别加上靶点序列，称之为TDT (Target-DRT-Target)。将RCR1、RCR2和TDT置于OsU3启动子与Nos终止子之间，Cpf1可对转录产物中TDT两侧的靶点序列进行切割，从而释放RNA修复模板。通过基因枪转化水稻愈伤，RDR及TDT载体均获得ALS基因精确修饰的水稻植株，其中RDR载体效率约为1.7%，TDT载体效率为4.6%。此外，通过水稻农杆菌转化法，利用TDT载体，也获得了OsALS基因部分同源重组的水稻植株。后代遗传分析结果表明，替换后的OsALS基因后代遗传符合孟德尔遗传定律。

　　该研究为通过基因编辑实现重要农艺性状等位基因替换和精准编辑，定向创制农作物新种质，进而加速育种进程，提供了新方法和新思路。

　　中国农科院作科所博士研究生李少雅为本文第一作者，作科所夏兰琴研究员和美国加州大学圣地亚哥分校赵云德教授为本文的共同通讯作者。

　　专家点评

　　王克剑 研究员 （中国水稻研究所）

　　自2012年CRISPR/Cas基因组编辑技术被发明以来，已被广泛应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组编辑。基因组编辑首先在基因组靶向位置产生DNA双链断裂（DSB），这些产生的DSB可通过非同源末端连接（NHEJ）或者同源重组（HDR）途径进行修复。NHEJ最常用于移码突变破坏基因功能，而HDR主要被用于对靶标序列的精准替换或定点插入。在多数物种中，NHEJ是DSB最主要的修复途径，而通过HDR途径进行精准修复的概率极低。HDR修复途径需要额外提供同源重组的供体作为修复的模板，在动物中可以较容易地将CRISPR/Cas系统及同源重组供体递送入细胞中，而在植物中，主要通过农杆菌侵染或基因枪轰击愈伤的方式来进行CRISPR/Cas系统以及DNA供体的递送。虽然利用基因枪转化或者双生病毒系统可以增加DNA模板数量进而提高HDR的发生概率，但是实现高效率的植物同源重组依然是一个巨大的挑战，限制了基因组编辑的拓展应用。

　　夏兰琴课题组和赵云德课题组合作，设计将RNA作为同源重组修复的模板。与通常使用的DNA模板不同，RNA模板可以在体内通过植物自身的转录系统产生，为同源重组修复持续提供更多的稳定模板。研究人员同时选择具有RNA/DNA双重切割能力的CRISPR/Cpf1基因编辑系统，在细胞核内同时加工产生用于靶向目标序列的crRNA及一起转录的模板RNA，既产生了DSB又提供了同源重组修复的RNA模板，成功获得乙酰乳酸合酶基因 (OsALS)定点替换成功的抗嘧啶羧酸类除草剂水稻植株，且在子代分离得到了定点替换成功且无外源转基因成分的植株。这项成果首次证明，除了通常使用的DNA模板，RNA同样可作为植物同源重组修复的模板。该工作开辟了利用植物RNA作为同源供体模板进行同源修复的新的研究方向，是植物基因组编辑领域的重大进展。在此研究基础上，进一步优化该策略的效率，有望解决目前植物同源重组频率低下的难题，加速通过基因编辑技术，精准改良农作物重要农艺性状，进而定向创制农作物新种质的进程。

　　论文链接：

　　https://doi.org/10.1038/s41587-019-0065-7