RNA的提取和纯化实验

试剂、试剂盒 氯仿焦碳酸二乙酯乙醇异丙醇苯酚-胍盐单相溶液磷酸盐缓冲液

仪器、耗材 离心机和转头移液器离心管锥形管平板匀浆器

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

氯仿

焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的 H20(GenHimterR105)

乙醇

70% 乙醇洗液（用 DEPC 处理过的 H20 配制）

异丙醇

苯酚-胍盐单相溶液（推荐 RNApure,GenHunterP501-P503)

磷酸盐缓冲液（PBS)

2. 离心机和转头

小离心机

3. 专用设备

50 ml 锥形管

1.5 ml 小离心管

1000ul(原文为 ml。—译者改）移液器

100~150 mm 平板

P10 移液器

Pdytron 匀浆器（用于从组织中提取 RNA)

二、方法

第一步：RNA 提取

方法 1: 从组织培养物中提取 RNA

1. 如果细胞贴在瓶壁或平板上，则倒掉培养基，将平板置于冰上。

2. 如果细胞是悬浮的，旋转离下细胞，并除去培养基。

3. 用 10~20 ml 的冷磷酸盐缓冲液（PBS) 漂洗细胞。

4. 倒掉 PBS，并用 1000ul 移液器吸去残留的 PBS。

5. 每 100~150 mm 平板加入 2 ml 苯酚-胍盐单相溶液（RNApure)，以裂解细胞（摇晃平板使溶液分布均匀）。这个体积足够裂解 100 万~1000 万个细胞。

6. 将平板放在冰上 10 min。

7. 将裂解液吸到两个标记好的 1.5 ml 离心管中。

方法 2: 从组织中提取 RNA

1. 在装有组织的 50 ml 锥形管中，加入至少 2 ml 苯酚-胍盐单相溶液（RNApure), 并置于冰上。组织和酚溶液的理想比例至少应该是 1:10。

2. 用 Polytron 匀浆器将组织搅匀，直到组织完全分散为止。

3. 将管子置于冰上10min。

4. 取 1ml 裂解液，分装到标记好的 1.5 ml 离心管中。

方法 3: 从血液中提取 RNA

1. 将血液产品离心，并除去血浆。

2. 按照上面从组织中提取 RNA 的说明逬行操作。

第二步：RNA 的纯化

1. 每毫升裂解液加入 150ul 氯仿，涡旋混匀 10min。

本方案可以在此处停止，并将裂解液放置在-80°C

2. 在 4°C 以最大转速离心 10min。

3. 小心地将上清液转移到一个干净的、标记好的 1.5 ml 离心管中。

4. 加入等体积的异丙醇，并在冰上放置 10min，然后剧烈地混匀或涡旋混匀 30s。

5. 将混合物在 4°C 以最大转速离心 10min。

6. 用 1ml 预冷的 70% 乙醇（用 DEPC 处理过的 H20 配制）洗涤 RNA 沉淀，在 4°C最大转速离心 2 min。

7. 倒掉乙醇。短暂离心后，用移液器吸去残留的洗液。

8. 将 RNA 在 5ulDEPC 处理过的 H20 中重新悬浮。

注意：如果 RNA 用于任何扩增反应，悬浮液中不要使用 SDS。

9. 取1ul RNA(用 P10 移液器）测定浓度，用1ml H20 稀释。在 260nm 下读数，注意 1OD260=40ug。