RTPCR实验流程

1、技术原理

实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个PCR进程，zui后通过Ct值与标准曲线的处理对未知样本进行定量分析，是zui常用的基因表达分析技术。有绝对定量与相对定量两种定量分析方法。

图 各种荧光定量曲线示意图

2、服务流程及质控

2.1 实验流程

• 样本的质检

• Nanodrop精准测定，样本消耗量低。

• 引物设计

• 有着多年的经验，比较透彻地掌握这方面的规律。

• 内参基因的选择

• 客户自己提供，我们进行验证；

• 我们选择多个内参，进行特定实验优选；

• 很据实验或客户需求，可同时进行双内参校正

• 检测平台

• ABI 7500（96 well），50ul 标准体系，满足少量实验需求。

• ABI 7900（384 well），20ul标准体系，满足大量实验需求，对照设在同板，结果均一。

2.2 实验质控

• 实验严格分区

• 防控污染zui有效的方法。

• 可靠的数据

• Ct值在18-30间，数据较准确；

• 与样本原始浓度、RT效率及PCR效率有关；

• 反应效率随设计引物差异而相差几十倍，优化的引物使得实验效率zui大化；

• 长期实验证实：较长的引物使实验效率显著改进，但易引起非特异，通过实验进一步优化而避免。