引物合成及各种问题总结
1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应......阅读全文
紫外线灭菌相关问题总结
1.紫外线灭菌是用紫外线管照射进行的。波长在220-300纳米的紫外线称为"杀生命区"，其中以260钠米的杀菌力最强。紫外线作用于细胞DNA，使DNA链上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体），抑制了DNA复制。另外，空气在紫外线照射下可以产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能
蛋白纯化常见问题总结（二）
3)Sephadex G-25(medium)柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗?若有，一般对盐浓度限度如何?大家别客气，除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得
颗粒计数器使用问题总结
仪器在测量设备的过程中总会遇到这样那样的问题，颗粒计数器使用也会遇见多种问题，常见的问题总结如下： 1、方法误差 是指由于使用的测量方法不完善，理论依据不严密，对某些经典测量方法做了不适当的修改简化所产生的误差，即凡是在测量结果的表达式中没有得到反映的因素，而实际上这些因素又起作用时所引
免疫荧光常见问题总结
1、问：免疫荧光：用免疫荧光方法做同样的内容，组织切片和培养细胞，两者操作过程中有哪些不同？参考见解：只是固定方法不同，细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤以及注意事项？参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光的双
关于PCR假阴性问题总结
PCR的假阳性问题深受重视，但我个人认为PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。其实PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。而PCR的假阴性
蛋白纯化常见问题总结（一）
蛋白纯化过程中常遇见一些问题，这里整理了以下几个蛋白纯化实验中遇见的问题及其解决方案。1)我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助
紫外线灭菌相关问题总结
1.紫外线灭菌是用紫外线管照射进行的。波长在220-300纳米的紫外线称为"杀生命区"，其中以260钠米的杀菌力最强。紫外线作用于细胞DNA，使DNA 链上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体），抑制了DNA复制。另外，空气在紫外线照射下可以产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透
合成的引物5’端是否有磷酸化？
合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。
刚合成的引物用降落PCR的原因分析
因为理论计算的TM值用来确定退火的温度只是一个参考呀,最合适的退火温度会因为各种原因而有所差异,就连PCR仪都会有影响的,我们实验室就是,好多都是在一台能拉出条带,而在另一台上就拉不出条带,或者相反的。降落(TD)PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法。由于开始时的退火温度选择高于估计的Tm值,随
随机引物合成法双链DNA探针标记法
随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活
pcr扩出目的片段及引物二聚体，哪出了问题
只要目的片段位置正确 无需去管引物及其二聚体的，结果可靠。究竟是不是引物二聚体 你从理论上就可以分析判断。一般常见情况是引物加过量了，在溴酚蓝位置常见亮带，在这中情况下，你不需要理他，若需要漂亮图片（发论文），2办法：可以减少引物加入量，同时稍微降低镁离子浓度；或者在保证底物不缺乏情况下，增加几个循
PCR引物设计及评价
【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或
PCR引物设计及评价
【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或
ELISA中常见问题及解决方法经验总结
【摘要】：ELISA 试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。相关专题 ELISA免疫实验技术 e
嘧啶和各种取代的嘧啶的合成方法
嘧啶和各种取代的嘧啶有多种方法合成。例如，巴比妥酸(2，4，6-三羟基嘧啶)可由脲与丙二酸二乙酯在醇钠的作用下缩合而成。巴比妥酸与磷酰氯一起加热，得2，4，6-三氯嘧啶，它与甲醇钠反应，又可得三甲氧基嘧啶。氯代嘧啶与氨或一级、二级胺反应，生成相应的氨基嘧啶。嘧啶的衍生物胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，是核
合成的引物进行PCR反应时无目的条带
合成的引物进行PCR 反应时无目的条带，怎么办?PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。1) 引物和模板是否配对，同源性有多大?2) 引物本身是否有立体结构.3) PCR反应用试剂是否能正常工作?4) PCR仪 是否工作正常?5) PCR反应条件是否合适?如果一切正常，还无法解决问题时，我
高速离心机－PCR问题的总结
pcr产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些zui好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质
蛋白质纯化常见问题总结
蛋白质纯化过程中常遇见一些问题，这里整理了以下几个蛋白质纯化实验中遇见的问题及其解决方案。1)我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我
总结几个液相色谱柱的问题
色谱柱是液相色谱仪的核心，在我们使用液相色谱仪的时候，保证液相色谱柱的柱效，延长色谱柱的使用寿命是很重要的事情，当我们使用的时候色谱柱如果出息压力过高或者过低等问题都是属于柱压问题。液相色谱柱如果压力过高是因为柱子里面产生了杂质，造成液体的流动力加大而所造成。下面为大家总结的几个液相色谱柱的问题
电磁流量计应用中常遇故障问题及总结解决方案
一、非轴对称流动造成的错误 电磁流量计的速度分布对称分布管轴，生成电极的流体总流量在1统一的电动势力，流量计的液体流量计的平均流体流动速度速度分布的幅度磁场率，但无关，而不是比例。对称轴，即粒子的运动物体，每一个不同的位置电极形状的感应电动势取决于电极的电极，在粒子的速度更大，更贴近，感应电动势较大
固相多肽合成的特点及主要问题分析
固相合成法对于多肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使
PCR引物设计及评价实验
实验方法原理聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实
PCR引物设计及评价实验
实验方法原理 聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引
简并引物设计方法及原则
相关专题简并引物设计简并引物常用于从已知蛋白到相关核酸分子的研究及用于一组引物扩增一类分子。简并引物设计方法（1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的
余氯测试方法各种常见问题与常识
余氯测试方法各种常见问题与常识传统的余氯测试方法主要有分光光度法和比色法，这二种方法的缺点是：需要5种以上的试剂和溶液，测试精度受样品的颜色和浑浊度的影响。 余氯一般是指溶液中游历氯（例如次氯酸根）浓度，而非氯离子浓度。所以余氯与氯离子是二个不同的含义。在水处理中的加氯量（一般加氯气）：一部分是实际
引物溶解引物保存
1. 如何测定引物的OD值？用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2~0.8之间（吸光度太高或太低会有较大的误差）。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1 ml 并在1 ml 标准比色皿中测定其吸光度
引物溶解引物保存
1. 如何测定引物的OD值？ 用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2~0.8之间（吸光度太高或太低会有较大的误差）。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1 ml 并在1 ml 标准比色皿中测定其
恒温核酸扩增反应引物探针设计问题合集
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司开发）。以此为基础的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全
用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针
实验方法原理 本方案以 poly(A) + RNA 作为模板，通过随机引物反应合成 cDNA 探针，这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。实验材料 反转录酶反转录酶缓冲液随机脱氧核苷酸引物模板 mRNA试剂、试剂盒 乙酸铵DTTEDTA乙醇HClNaOH酚氯仿胰 RNA 酶抑制剂SDS Tris
刚合成的引物用降落PCR的原因是什么？
因为理论计算的TM值用来确定退火的温度只是一个参考呀,最合适的退火温度会因为各种原因而有所差异,就连PCR仪都会有影响的,我们实验室就是,好多都是在一台能拉出条带,而在另一台上就拉不出条带,或者相反的。降落（TD）PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法。由于开始时的退火温度选择高于估计的Tm值，随