质粒DNA质量如何评估才可靠？
质粒抽提过程中有很多步骤会影响最后的产量和质量，那么如何评估质粒DNA的产量和质量呢？目前使用分光光度法定量质粒DNA和通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA产率和质量的分析是两种最常用的方法。溶液中的核酸浓度可通过260 nm的吸光度方便地进行计算。A260的数值处于0.1至1.0之间时测量结果具有良好的重复性，但当A260数值小于0.1或大于1.0的时候，结果的可重复性将显著下降。而且，3.0以上的读值是无法使用的，它可能会潜在导致对DNA质量的低估。因此，为了获得可靠的DNA分光光度定量结果，A260的读值需要处于0.1至1.0之间。当检测小量DNA时，使用琼脂糖凝胶电泳进行的定量分析可能更为可靠。造成较低的产率和质量的可能因素有很多。为了确定存在问题的环节，可于每一纯化步骤都保留一小部分样品，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。制备样本如各个实验方案和下列表格中所示，从澄清裂解液（样本1）、流出液（样本2）、QC洗涤缓冲液......阅读全文
质粒DNA的去磷酸化实验
去除 5' 端的磷酸基可防止质粒 DNA 的自身连接和环化。在体外连接反应中，DNA 连接酶可在邻近的两个分子间形成磷酸二酯键。但只有当一个分子的 5' 端带有磷酸基另一分子的 3' 端带有羟基时，这一反应才能完成。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。实验方法原理
影响质粒DNA提取的因素有哪些
这个要看是用试剂盒提还是手提。试剂盒提取的话就很方便很好操作，试剂、吸附柱什么都是商品级的，问题都不大，主要是看你培养的菌质量如何，如果培养菌是挑取的是假阳性或者是培养基抗性出问题，就会因为质粒没有或者量过少而检测不出来，其次的话就是Buffer要加的是无水乙醇，不能加错，其他操作按说明书就没有问题
质粒DNA的转化(CaCl2法)
实验原理受体细胞经过一些特殊方法如化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(即带有异源DNA分子的受体细
质粒DNA的去磷酸化实验
实验方法原理 去除 5' 端的磷酸基可防止质粒 DNA 的自身连接和环化。在体外连接反应中，DNA 连接酶可在邻近的两个分子间形成磷酸二酯键。但只有当一个分子的 5' 端带有磷酸基另一分子的 3' 端带有羟基时，这一反
碱裂解法提取质粒dna的原理
碱裂解或碱提取是分子生物学中用于从细菌中分离质粒DNA的方法。方法首先，含有感兴趣质粒的细菌被培养，随后通过离心浓缩细胞物质（包括DNA）至容器底部形成一个沉淀物。上清液被弃去，然后将沉淀物重新悬浮在含有EDTA的生理缓冲液中。EDTA的作用是与二价金属阳离子如镁离子和钙离子结合，这些离子对于DNA
碱裂解法提取质粒dna的原理
碱裂解或碱提取是分子生物学中用于从细菌中分离质粒DNA的方法。方法首先，含有感兴趣质粒的细菌被培养，随后通过离心浓缩细胞物质（包括DNA）至容器底部形成一个沉淀物。上清液被弃去，然后将沉淀物重新悬浮在含有EDTA的生理缓冲液中。EDTA的作用是与二价金属阳离子如镁离子和钙离子结合，这些离子对于DNA
质粒dna跑电泳应该出多少条带
3条。用试剂盒这种、或者提取时候操作比较好的、同时菌也摇的比较密的，一般抽提出来的质粒跑电泳是可以看到3条带的，他们从上到下分别是开环、线性、负超螺旋的质粒。主要原因是琼脂糖凝胶电泳是根据分子在电场中的迁移速率来区分不同大小的DNA的，但这有一个局限性，就是凝胶本身是存在空间位阻的，同一个质粒上述3
怎样提取微生物的质粒（DNA）
碱提法：一、试剂准备1.溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0）.1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml,0.5M EDTA（pH 8.0）10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml.在10 lbf/in2高压灭菌
碱裂解法提取质粒dna的原理
碱裂解或碱提取是分子生物学中用于从细菌中分离质粒DNA的方法。方法首先，含有感兴趣质粒的细菌被培养，随后通过离心浓缩细胞物质（包括DNA）至容器底部形成一个沉淀物。上清液被弃去，然后将沉淀物重新悬浮在含有EDTA的生理缓冲液中。EDTA的作用是与二价金属阳离子如镁离子和钙离子结合，这些离子对于DNA
质粒DNA的分离、纯化和鉴定－（三）
操作步骤 一、 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含50μg/ml Amp）中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。 二、 质粒DNA
DNA体外转染试剂_如何准备转染所需的质粒DNA
转染效率受到诸多因素的影响，除了细胞、培养基和载体等影响因素外，另外一项非常重要的因素便是DNA的质量。为了比较不同厂家的转染效率，我们分别从三家不同的供应商购买了质粒制备试剂盒来制备pEGFP-N3质粒DNA，并通过不同的方法将制备的pEGFP-N3质粒转运至NIH-3T3细胞。pEGFP-N3质
质粒DNA的转化和染色体DNA的转化差异
质粒DNA的转化和染色体DNA的转化有显著的不同。在一般情况下前者的转化效率远远低于后者。但如果先用一定浓度的钙离子处理大肠杆菌细胞，再用质粒DNA和染色体DNA对它做转化实验则情况恰好相反。此外，质粒DNA很容易进入去掉了细胞壁的细菌的原生质体，说明对它的吸收并不通过专门的接受位点；质粒DNA的转
分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处
分离质粒时，可以将质粒去得很干净。方法为：先用TE之类的试剂将菌液悬浮起来，再用NaOH和SDS将菌液裂解（起裂解作用的主要是NaOH，但此时，SDS可以与蛋白很好的结合）。第三步，加入酸中合第二步中的碱，并且将SDS沉淀下来，同时，SDS和蛋白也一起沉淀下来，而基因组上面有很多的蛋白，这样基因组就
质粒dna的提取和纯化方法有哪些
碱裂解法、柱纯化法、煮沸法
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已
DNA复制起点pBR322质粒的优点
pBR322质粒的优点：（1）具有较小的分子量。4363bp，2.6×106Da，（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。
一步法提取质粒DNA
一步法提取质粒DNA主要用于鉴定阳性克隆。主要步骤如下：收集1.5mL菌体，彻底除去培养基；加入50ulSTE缓冲液重悬菌体；加入50ul酚：氯仿;异戊醇（25：24：1），混匀；12000rpm离心5分钟，取上清到另一离心管中；加入NH4Ac至终浓度2M，并加入2倍体积的乙醇，混匀，室温或冰上放置
质粒DNA的提取方法总共有哪些
(一)碱裂解法提取质粒[实验原理]碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结
煮沸裂解法制备质粒DNA实验
煮沸裂解法小量制备质粒DNA 煮沸裂解法大量制备质粒DNA 实验方法原理 经 Triton X-100、溶菌酶和加热处理可从小量（1~2 ml )
大肠杆菌质粒DNA的提取及转化
实验概要本实验包括大肠杆菌质粒DNA的提取，质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，大肠秆菌感受态细胞的制备及质粒DNA高频转化大肠杆菌。实验步骤1. 大肠杆菌质粒DNA的提取碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1) 接1%含质
煮沸裂解法制备质粒DNA实验
实验方法原理 经 Triton X-100、溶菌酶和加热处理可从小量（1~2 ml ) 细菌培养物中分离质粒 DNA 所获得的质粒则可以用电泳或限制性内切核酸酶消化的方法鉴定；经 PEG 处理进一步纯化后，其可以用做 DNA 测序反应的模板。试剂、试剂盒 抗生素乙醇异丙醇乙酸钠STETTE溶菌酶仪器
质粒DNA的提取方法总共有哪些
(一)碱裂解法提取质粒[实验原理]碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结
实验中提取质粒DNA时的注意点
提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。将amp浓度提高到200ug/ml，下班前接种，次日一早收获菌体，此时OD虽然不高，质粒丰度却不一般。菌体量少些，操
如何鉴定提取质粒DNA的质量和含量
紫外分光光度计定量。方法用大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒，紫外分光光度计定量后，根据重组质粒分子量计算其拷贝数，稀释成梯度浓度的荧光实时定量PCR的标准品，取1.0×106、1.0×104和1.0×102拷贝/μl高中低3个浓度的标准品，反复冻融1、6、11、15次和21
克隆化酵母DNA的操作实验——穿梭质粒
实验材料酵母实验步骤1. 构建其必需基因的染色体拷贝已被破坏的单倍体菌株，及带有完整的必需基因和URA3选择标志的YEp质粒。2. 将必需基因亚克隆到YCp载体（带有URA3以外的选择标志），取约10~20 μg 用羟胺或其他技术进行诱变。3. 转化至步骤1的菌株中，在添加了尿嘧啶的省却成分平
重组质粒（dna－recombinant－plasmid）的筛选实验步骤
实验仪器控温摇床水浴锅 冰箱（-20,‐70℃） 超净工作台 培养箱 实验试剂 Amp LB IPTG X-Gal 平皿 玻棒 三角瓶 离心管 移液器 tip 实验步骤： 20人／班 1平皿／人 挑取可疑的白色菌落，移植于2mL的LB中，250转/分摇菌、37℃培养过夜。以快
质粒DNA的酶切原理和操作步骤
1．目的学会用限制性内切酶切割质粒DNA。2．原理II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水
质粒DNA的超速离心分离（二）
用以上公式算出的离心时间和实际离心结果非常接近。从公式可以看出T反比子（N4、r2），显然在CsCl不结晶析出的前提下提高（N4、r2）将会减少离心时间,而增加转速的效果特别明显。但是对于某些较低转速转头（如 65,000rpm以下）CsCl自形成梯度所需时间过长（10小时）以上，因此质粒DNA纯样
质粒DNA导入细菌细胞实验——电转化法
实验方法原理高压电转化简单，快捷可靠，而且是目前效率最高的质粒DNA转化大肠杆菌方法。不过该方法需要电转化装置。实验材料菌落试剂、试剂盒LB甘油SOC仪器、耗材平板离心瓶聚丙烯管电阻器电转化池实验步骤1. 接种一个单菌落于5 ml LB培养液，37°C温和振摇培养5 h或过夜。2. 将2.5 m
质粒DNA的超速离心分离（一）
一、简述近代质粒DNA分离纯化以从大肠杆菌中分离为代表，鉴于大局杆菌（E.coli）在分子生物学研究中的重要地位，从E.coli中分离纯化质控DNA〈Piasmid DNA〉成为近年来超离心技术中一个重要课题。而质粒DNA的快速分离纯化又对超离心设备（超速离心机、转头和附属设备）提出了更高要求。E.