cDNA文库的构建3

阶段 5:SepharseCL-4B 凝胶过滤法分离 cDNA

材料

缓冲液和溶液

乙醇

乙酸钠（3 ml/L,pH5.2)

TE(pH7.6)
含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)

Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)

凝胶

琼脂糖凝胶（1%)
见步骤 8。

核酸和寡核苷酸

cDNA
阶段 4 中步骤 13 及 14 制备的 cDNA。

DNA 参照物
DNA 参照物应为末端标记的片断，长度 200bp~5kb。

专用设备

过滤的压缩空气

止血器或软管夹

带有弯头的皮下注射针头

1 ml 无菌吸管

聚乙烯管

剪刀

Sepharose CL-4B
用含有 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 对市售糊状 Sepharose CL-4B 清洗数次。这种清洗可以去除存留在某些批号凝胶中的连接抑制剂。Amershan Pharmacia 生物技术公司提供已经装填好的 Sepharose CL-4B 柱 (Sizesep400 离心柱)。

乙烯基泡沫管

Whatman3 MM 滤纸

方法

Sepharose CL-4B柱的制备

1. 用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1 ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。

2. 将一段无菌的聚氯乙烯软管（通常用于蠕动泵的管型）与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1mol/LNaCl 的TE(PH7.6)溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。

3. 在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，0.1mol/L氯化钠的TE(pH7.6)平衡了的SepharoseCL-B填充于泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。如有必要，可加入更多的SephamseCL-4B, 直至填充基质几乎充满吸管为止。

柱子直径应约为 27x0.3 cm。

4. 将几倍柱床体积的含0.1mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。

依据大小分离回收DNA

5. 用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积50ul或更小)，放开止血钳，使 cDNA进入凝胶。用50ul TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA 的微量离心管，将洗液亦加于柱上。用含0.1mol/LNaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。
重要: 任何时候都不可使柱子流干！

6. 用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管二滴（约60ul), 直至将所有放射性洗脱出柱为止。

7. 用切仑科夫（Cerenkov)计数器测量每管的放射性活性。

8. 从每一管中取出一小份（约以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb)的 DNA片断作标准参照物，通过1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20°C，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。
制备的琼胞糖凝胶应尽可能薄以便加快电泳完成后干燥的过程。
标准DNA参照物中放射性量应是cDNA峰值放射性量的 30%。

9. 电泳后将凝胶移至一张Whatman3 MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器（市售）上干燥。干燥过程前20 min至30 min于 50°C加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥l~2 h。

10. 置-70°C加增感屏对干燥的凝胶继续X射线片曝光。
柱洗脱早期收集的部分，放射性自显影应显示cDNA大小为5~7kb的片状放射性：随后收集的 cDNA越来越小。

11. 在cDNA长度>500bp 的收集管中，加入 0.1 倍体积的3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和二倍体积的乙醇。于 4°C 放置至少 15 min 使cDNA 沉淀，用微量离心机于 4°C 以 12000 g 离心 15 min, 以回收沉淀的 cDNA。
选择分级收集一定要十分谨慎，切不可选取含有痕量小于500bp 的cDNA的收集管。否則，文库中将含有数量很大的短 cDNA 链克隆。

12. 将 DNA 溶于总体积为20ul的 10 mmol/LTris-HCl(pH7.6) 中。

13. 测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于与噬菌体臂相连接的DNA 总量 (有关 cDNA 第二链的计算，参见阶段 2 步骤 8)。

如果一切顺利，10ug poly(A)RMA 至少可产生 250~400ng(可能髙至 3ug) 的长度大于 500bp 的 cDNA。

阶段 6:cDNA 与λ噬菌体臂的连接

材料

缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。

ATP(10 mmol/L)

SM

酶和缓冲液

噬菌体 T4DNA 连接酶