icSHAPEMaP可探测完整的RNA结构

　　RNA的结构决定了它的生物功能，然而目前的RNA结构探测方法只能捕获部分结构信息。测量完整（即全长）的RNA结构的能力将促进对小RNA的功能和调节机制的调查，并确定功能位点的短片段。

　　 2021年6月7日，来自清华大学张强锋和斯坦福大学Mark A. Kay等研究团队在Nature Communications上在线发表了题为“RNAstructure probing reveals the structural basis of Dicer binding and cleavage”的研究论文，提出了icSHAPE-MaP，一种结合体内选择性2′-羟基酰化和突变分析的方法来探测完整的RNA结构。

　　硫酸二甲酯（DMS）、1-甲基-7-硝基异氰酸酐（1M7）、2-甲基烟酸咪唑化物（NAI-N3）和Kethoxal是广泛用于体内RNA结构探测的试剂。DMS在体内修改单链区域内腺嘌呤和胞嘧啶碱基的N1和N3位置，而NAI-N3则对所有四个单链碱基的游离2′-羟基进行丙烯酸化，从而可以通过选择性的2′-羟基酰化后的引物延伸（icSHAPE）对转录组进行体内结构探测。icSHAPE已被用于发现与不同生物过程相关的RNA的结构变化，如翻译、RNA-蛋白质相互作用和活细胞中的N6-甲基腺苷修饰。

　　结构探测方法，包括DMS-seq和icSHAPE，测量在化学诱导的核苷酸修饰处产生的逆转录截断，以确定一个核苷酸处于单链构象的概率。然而，一个限制是，由于短测序读数的映射损失，探测目标的3′末端的结构信息将丢失。这个目标可能是一个完整的转录本或重点研究中的一个片段，例如一个长RNA的功能区。当应用这些方法对包括小RNA（sRNA，长度<~200 nt的RNA）或RNA结合蛋白（RBPs）的结合位点等尺寸较短的目标进行结构分析时，这一注意事项成为一个大问题。

　　为了克服这个3′末端脱落的问题，DMS-MaPseq和SHAPE-MaP测量逆转录过程中产生的突变率。然而，DMS-MaPseq提供部分核苷酸覆盖（只能探测腺苷 "A "和胞苷 "C "核苷酸），目前的SHAPE-MaP试剂只有中等的细胞膜渗透能力，限制了它们在体内的使用。

　　Dicer属于RNase III家族，可将双链RNA（dsRNA）和pre-miRNAs分别裂解为成熟的小干扰RNA（siRNA）或miRNAs。成熟的miRNAs/siRNAs装入Argonaute蛋白，形成RISC复合体，通过引导链和目标基因之间的Watson-Crick碱基配对，抑制目标基因的表达。Dicer如何精确地确定其在底物上的裂解位点对RNA干扰（RNAi）和miRNA生物生成具有核心意义。

　　研究提出，Dicer从dsRNA底物的3′或从5′端测量一定数量的核苷酸，以选择pre-miRNA和dsRNAs。此外，对shRNAs和pre-miRNAs的体内研究表明，Dicer使用单链区域来精确锚定裂解位点的下游2-nt。然而，关于这些机制何时以及在多大程度上在pre-miRNA加工中运作，问题仍然存在。

　　此外，Dicer还与各种底物结合，但没有明显的经典miRNA或siRNA加工活动，这表明它在RNA代谢中还有其他作用。Dicer是否以及如何区分可裂解和不可裂解的底物尚不清楚。

　　在这项工作中，提出了一种在活细胞中探测完整RNA结构的方法。简而言之，利用icSHAPE试剂和反转录中的突变分析的优势，开发了一种结构探测方法，icSHAPE-MaP。为了证明其能力，使用icSHAPE-MaP来确定细胞sRNAs的完整结构信息。此外，我们将icSHAPE-MaP与RNA免疫沉淀（RIP）相结合，确定RNA内切酶Dicer底物的结构图。通过结合icSHAPE-MaP和三级结构建模获得的结构信息，发现空间距离测量是Dicer介导的前miRNA加工中的一个有影响力的参数。