Tips！10分钟了解液相色谱柱填装技术！

　　目前大多数实验室通过购买商品色谱柱来满足分离/分析之需

　　液相色谱柱的填装，一般需要有较高的技巧和熟练的技能。因此，有人甚至将“装柱”看作是“艺术加技术”

　　但是只要掌握了一些基本的规律和方法，任何实验室都可以填装出具有较高柱性能的色谱柱

　　高压匀浆法

　　将填料悬浮在适宜的匀浆液中制成匀浆，在其尚未沉降之前，使用气动高压泵 将其以很高的流速压进柱中，便可制备出填充均匀的柱子。高压匀浆法的设备，如图所示。

　　装柱机的核心是气动高压泵，若输入1MPa压强的压缩空气，则相同的压力会传递至高压端柱塞上，而高压柱塞面积仅为低压端的1/100，因而其输出压强亦提高至100MPa。由于气动高压泵很容易获得高压、高流速的输液，故很适于柱子的填充之需。

　　在装柱之前，先确定所用的柱型，以确定选用多大的匀浆罐体积。例如，常用的HPLC柱为φ4.6mm×250mm，其内腔体积约为4.2mL，约需3.5g填料。为保证填充的成功，需适当过量15%-20%为宜。如使用4g填料充填它，选择固  -液比约为1:10，则匀浆罐体积以4mL为宜。若罐过大，则可在匀浆罐内装入一个以惰性材料（如聚四氟乙烯或不锈钢）制的衬套将其调整至所需体积。

　　将选用的柱子仔细用乙醇或丙酮清洗干净，并以干净的热风吹干。如柱管内壁污染较重，也可以用表面活性剂及去离子水清洗，除去污垢。但应注意不要伤及内壁表面的光洁度，尤其不能造成轴向的划痕。将清洁的柱管的一端装配上带滤板的柱头，另一端则连接至匀浆罐上。

　　配制勾浆液是高压匀浆法的重要一环，不同的填料应采用不同的匀浆液。例如，填充硅胶正相柱，可以使用1:1 的氯仿/甲醇；对于C18反相填料，可以使用适宜比例的正己烷氯仿混合溶剂。称取所需重量的填料，将其置小烧杯中，按其重量的10 倍量（一般也可以按体积计，即10mL的匀浆液中加入1g 重的填料）加入匀浆液。摇动或搅拌均匀后，将其移至超声波浴中，令填料粒子均匀而稳定地悬浮起来。超声处理的时间不宜过长，一般应不超过2-3min，过长则可能造成颗粒的破碎。

　　将准备好的勾浆液立即倒入匀浆罐中，装满后，将匀浆罐盖好、旋紧，再以针筒抽取一定量的匀浆液，从盖子上的连接孔中插入匀浆罐内部并加注匀浆液至从连接孔中溢出为止。这一操作的目的是排除匀浆罐中的空气泡，空气泡的存在会妨碍向系统中迅速地施加压力。抽出注射针并将罐与气动放大泵的出液管路相连。确认连接正确且牢固后，开启气动高压泵，将洗脱液（正相时可以使用氯仿，反相时可使用甲醇）高速压入罐内。

　　以常见的5μm多孔硅胶填料为例，填装压力为50MPa左右（细孔硅胶可至70MPa）。这里使用的是瞬间升压的方式，也有文献报道使用程序加压。加压时，匀浆液中的填料滞留于柱尾的滤板上而匀浆液则被排除于柱外。开始时，排出的匀浆液因含部分气体，释压后会逸出而使液体浑浊。待全部匀浆液被排出后，因顶替液黏度较少而流速亦稍加大，且排出液有明显的外观上的变化。此时，可以稍稍降低填充压力，例如，降至约35MPa，并维持30-40min，然后，在约30min, 内逐步将压力降至常压。降至常压后，宜静置一段时间，以让柱床内的压力平衡。拆下已填装好的柱子并装配上带有筛板（滤网）的柱头，即已完成柱子的填装。

　　实验和理论研究均指出，以上述下流式匀浆法难以填装成长柱子，其原因是，随着已填充柱床的增高，对流体的阻力亦逐渐增加，使在一定压力下通过柱床的流速降低，亦即柱床的增长速度变慢，在这一过程中，填料颗粒的沉降亦在进行，导致所填充柱床的紧密性和均匀性降低。为保证达到一定柱效，一次填充的单柱长度不宜过大。

　　为制取更长的柱子，可以使用上行法。曾有报道，使用3μm 填料，以上行法可以制备长达1m 的柱子，且其柱效与短柱子相类似。上行法中使用的匀浆液浓度比下行法要小一些，速度也慢一些，因此所填充的柱床相对较均匀。近年来，由于微柱色谱和毛细管电色谱的发展，需要填微色谱柱乃至毛细管色谱柱，而上行法则可以用作为微柱的填充方法之一。

　　对于高效柱、特别是现在流行的以2-10μm细柱径填料填装的高效分析柱，则必须使用湿法，即匀浆法装柱。随着粒径的减小，静电作用和表面能的加大，粒子间倾向于聚集和“粘结”，若以干法填装，它们会粘附在连接管及柱壁上，也会因强烈的静电作用彼此排斥，因而难以填装出均匀而紧密的柱床。这样，必须改以湿法装填，填料悬浮于适宜的液体中消除上述不良作用。

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