PCR技术迈入第三代微滴式数字PCR

　　你说世界变化快不快，PCR已经迈入第三代!近日，一种称为微滴式数字PCR(ddPCR™)的新技术出现在《Analytical Chemistry》杂志上，它能够确定样品中待测靶分子的绝对数目。

　　第一代PCR就是我们目前最常用的终点PCR技术，通过凝胶电泳获得定性的结果。风靡全球的实时定量PCR技术为第二代，它利用荧光试剂监控扩增，来实现相对定量。在开展基因表达分析时，需要标准曲线或参考基因来协助定量。

　　微滴式数字PCR则为第三代PCR，它不再依赖Cq值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。微滴技术让数字PCR更低成本，且更实用。

　　文章的第一作者为Bio-Rad公司的Ben Hindson博士。Bio-Rad公司在不久前推出了QX100™ 微滴式数字PCR系统，带来了ddPCR技术。此系统能够确定核酸分子的绝对数目，让研究人员无比精确地研究生物学。Hindson博士表示，ddPCR 克服了之前数字PCR系统的缺陷，如成本高、通量有限且流程复杂。

　　QX100 微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

　　这篇新发表的文章证明了QX100微滴式数字PCR系统在三个方面的作用：拷贝数变异(CNV)研究、稀有等位基因检测和血浆DNA定量。

　　对于CNV研究，大量的微滴提供了足够的精确度，能准确测定拷贝数状态。利用QX100微滴式数字PCR系统来筛查HapMap样品的CNV，拷贝数状态可完全分辨。

　　对于稀有等位基因的检测，将突变DNA与高度同源的野生型DNA分开，提高了灵敏度。有了QX100系统，研究人员能够检测BRAF V600E中低至0.001%的突变片段，与定量PCR相比，灵敏度提高1000倍。

　　最后，研究人员还利用微滴式数字PCR技术准确检测了孕妇血浆中高度片段化的DNA。这种方法有望发展成无创的产前诊断技术，因此现在也很热门。

　　作者认为，此系统能够协助研究人员探索复杂的遗传图像，发现并验证新的疾病关联，并定义分子诊断的新时代。