脱水蔬菜中沙门氏菌不同检测方法的对比研究

脱水蔬菜是我区重要的出口产品之一 ,其质量直接影响创汇。近几年来无论是消费者还是检验机构对食品的安全卫生问题日趋重视 ,在我国加入ＷＴＯ后 ,越来越多的外商在外贸合同中严格规定了对脱水蔬菜中沙门氏菌进行检测的条款 ,而现在常用的检测沙门氏菌的方法是按国家标准ＧＢ4 789.4 - 94 (1) 进行的 ,该方法繁琐复杂 ,检测时间太长 ,已远远不能满足对外贸易的需要。近些年来 ,随着科学技术的飞速发展 ,出现了一种新型的微生物检测仪器———自动荧光酶标分析仪 (ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ) ,并已在禽肉制品、乳制品沙门氏菌检测中得到了初步试验(2 ) ,但在脱水蔬菜的沙门氏菌检测中 ,报道较少。本课题的研究 ,主要应用“自动荧光酶标分析仪”检测沙门氏菌并与国家标准ＧＢ4 789.4 -94检测方法进行比较 ,以加快脱水蔬菜检验微生物指标的检测速度 ,从而进一步把好出口脱水蔬菜的质量关。1　方法和器材1.1　仪器及试剂仪器 :自动荧光酶标分析仪 (ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ)培养基 :按国家标准和自动荧光酶标分析仪操作手册分别制备相应的培养基。标准菌株 :伤寒沙门氏杆菌 ,菌株编号 5 0 0 86 - 4 ,来自于国家质检总局商检研究所。1.2　样品制备两种检测方法的采样制样方式基本相同 ,均按国家标准ＧＢ4 789.1- 94 (3 ) 和ＧＢ4 789.4 - 94中的要求进行。1.3　实验方法1.3.1　ＧＢ4 789.4 - 94方法称取 2 5ｇ脱水蔬菜样品加入装有 2 2 5ｍｌ缓冲蛋白胨水的瓶中 ,于 36± 1℃培养 4ｈ ,然后各吸取 10ｍｌ分别转种于10 0ｍｌ氯化镁孔雀绿增菌液和 10 0ｍｌ亚硒酸盐胱氨酸增菌液中 ,于 36± 1℃培养 18～ 2 4ｈ。取上述增菌液 1环划线接种于 1个亚硫酸铋琼脂平板 (ＢＳ)和 1个ＤＨＬ琼脂平板上 ,于 36± 1℃培养 18～ 2 4ｈ(ＤＨＬ)或 4 0～ 4 8ｈ(ＢＳ) ,观察菌落。挑取可疑菌落分别接种于三糖铁琼脂、蛋白胨水 (靛基质 )、尿素琼脂、氰化钾培养基和赖氨酸脱羧酶培养基 ,于 36±1℃培养 18～ 2 4ｈ ,对以上生化反应进行结果判断 ,必要时补做ＯＮＰＧ、甘露醇和山梨醇试验。报告结果。1.3.2　自动荧光酶标分析仪 (ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ)方法原理 :以酶联荧光免疫 (ＥＬＦＡ)为基础检测沙门氏菌抗原 ,所有试验步骤均由ＶＩＤＡＳ系统自动完成。固相容器(ＳＰＲ)起固相和加样器作用 ,ＳＰＲ用高度特异的单克隆抗体包被。待测样本经过前增菌、选择性增菌和后增菌后 ,再将煮沸过的增菌肉汤加于试剂条上 ,样本将在ＳＰＲ内自动定时循环 ,如果样本中有沙门氏菌抗原则与ＳＰＲ内侧包被的单克隆抗体结合 ,所有未结合的样本则被洗去。标记有碱性磷酸酶的抗体在ＳＰＲ内、外循环并与ＳＰＲ壁上的任何沙门氏菌抗原结合 ,最后洗去未结合的复合物。底物磷酸 4 -甲基伞形酮则被ＳＰＲ壁上的酶分解成有荧光的产物 4 -甲基伞形酮 ,ＶＩＤＡＳ的光扫描仪自动测定其荧光强度 ,根据所测荧光强度得出试验值 (ＲＦＶ)并和标准比较 ,然后判断出样本阳性或阴性结果。方法 :将脱水蔬菜样品按 1∶10比例稀释于缓冲蛋白胨水中 ,在 36± 1℃培养 18～ 2 4ｈ。以下操作分两步进行 :(1)吸取 0 .1ｍｌ缓冲蛋白胨水加于 10ｍｌＲＶ肉汤中 ,在 4 1～ 4 2℃培养 6～ 8ｈ ,然后吸取 1ｍｌＲＶ肉汤加到 10ｍｌＭ肉汤中于 4 1～ 4 2℃培养 18ｈ ;(2 )吸取 1ｍｌ缓冲蛋白胨水加于 10ｍｌ亚硒酸盐胱氨酸增菌液中在 35～ 37℃培养 6～ 8ｈ ,然后吸取 1ｍｌ亚硒酸盐胱氨酸增菌液加到 10ｍｌＭ肉汤中于 4 1～ 4 2℃培养 18ｈ。最后再从 (1) (2 )两步中的Ｍ肉汤里各吸取 1ｍｌ放入同一试管中于 10 0℃水浴中煮沸 15ｍｉｎ ,然后吸取 5 0 0 μｌ按仪器使用说明注入试剂条中 ,上机操作。仪器运行 4 5ｍｉｎ后自动分析结果并打印出报告。1.3.3　用沙门氏菌标准菌株按以上两种方法增菌培养并和脱水蔬菜样品同步进行测试。2　结果 (附表 )3　讨论3.1　运用以上两种方法对同一种脱水蔬菜样品和沙门氏菌标准菌株进行对比试验 ,其结果完全一致 (见附表 )。3.2　国家标准ＧＢ4 789.4 - 94作为检验沙门氏菌的常规经典培养方法 ,其检验结果是准确可靠的 ,但是检验时间太长(一般需要 5～ 7天 ) ,过程复杂 ,已经不太适应进出境食品快速检验的要求 ,而且沙门氏菌作为一种食源性的致病菌是食品安全卫生检验中的必检项目 ,其危害性也要求医疗机构和检验机构能够快速鉴别。3.3　本次实验初步验证了自动荧光酶标分析仪 (ＭＩＮＩＶＩ ＤＡＳ)检测脱水蔬菜中的沙门氏菌具有自动化程度高、时间短 (4 8小时即可出结果 )、操作简便、灵敏度强等优点 ,但是该仪器所配备的试剂价格较贵 ,导致其检测费用比常规培养方法略高 ,因此较为适合样品检测量多的检验机构、食品企业以及医疗卫生机构。3.4　常规培养方法是通过增菌、分离、生化试验、血清学分型鉴定等过程来检测沙门氏菌 ,而自动荧光酶标分析仪(ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ)只需要对增菌液进行检验 ,就能用已知的抗体来检测相对应的抗原 ,从而判定样品中是否含有沙门氏菌。3.5　本次实验仅限于脱水蔬菜样品的检验 ,对于其它种类的食品有待于作进一步更深入的试验研究。4　结论通过本次对比实验我们初步认为 ,自动荧光酶标分析仪 (ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ)检测脱水蔬菜中的沙门氏菌 ,其结果是较为可靠的 ,检测时间也比常规培养方法大为缩短。因此作为一种快速初筛方法用来检测沙门氏菌是完全可行的 ,符合快速检测的要求。