PCRELISA端粒酶检测法

3.1.2组织中提取物的制备：

—测定端粒酶活性的组织标本准备，需要小心的采样并保存临床材料，因为肿瘤细胞的污染可产生正常组织中的假阳性信号，而由于不恰当的保存也可在肿瘤样本中产生阴性信号。如不是立即用于端粒酶PCR ELISA组织样本应以小片在液氮中休克性冷冻，并保存在-80℃。

—冰上孵育30分钟。

—2-8℃，16000g离心细胞裂解液20分钟。可用冷冻台式离心机及离心管。

—小心将上清液移入新的离心管中，确保无组织残片被带入，我们建议仅抽提175μl组织提取物，以标准方法测定蛋白浓度，在液氮中休克性冷冻小份组织提取物，将提取物存放在-80℃。

3.2端粒酶重复序列扩增步骤（TRAP反应）。

—对于每一待例检测样本，先将25μl反应复合物加入适合PCR扩增的管中，加入1-3μl细胞提取物（相当于1*10³-3*10³细胞或1-50μg总蛋白）。并加入无菌水至总体积50μl，所有吸取步骤在冰上进行。

—将离心管置于PCR仪中，照下列步骤进行引物延伸/扩增反应。

3.3杂交及ELISA反应流程：

—每个样品取20μl变性试剂加入适宜的离心管中，若有大量样本，建议使用无核酸酶包被的微孔板MTP。

—加入5μl扩增产物，15-25℃孵育10分钟。

—每个离心管内加入225μl杂交缓冲液，用振荡器完全混匀。

（如需要，杂交混合物量可以用于二次检测扩增产物。）

—取出100μl混合物加入试剂盒中已包被的微孔板的每个孔中，并用盖子盖住小孔以防蒸发。

—将MTP微孔板置于37℃，300rpm的振荡器中孵育2小时。

—弃去全部杂交液，以清洗缓冲液洗三次，每孔250μl每次至少30秒，小心弃去冲洗液。

—每孔加入100μl抗-DIG-POD工作液，用盖子盖上MTP，15-25℃（18-22℃）置于300rpm的摇床上孵育30分钟。

—完全弃去溶液，以每孔250μl清洗缓冲液冲洗5次，每次至少30秒，小心弃去冲洗缓冲液。

—每孔加入100μlTMB底物溶液预热至室温，盖上盖子，在300rmp的摇床上孵育10-20分钟。

——不要移去反应底物，每孔加入100μl终止试剂以终止反应。

注意：加入终止液后等已反应的POD底物的颜色从蓝转黄，这是取得zui高敏感度所必要的。

——使用ELISA酶标仪，测定加入终止液后30分钟内标本450nm吸收值（参照波长为690nm）。

4.结果分析：

吸光值为A450nm，参照空白对照读数（A690nm）。

4.1阴性对照：

将细胞提取物与无DNA酶的RNA酶预孵育，降解端粒酶内源性RNA作为检测端粒酶的阴性对照，另一种方法为热处理以取得阴性对照。用RNA酶处理标本，阴性对照zui大的吸收值为0.25A450nm-690nm，如果数值较高，整个实验包括TRAP反应需重新进行。

4.2阳性对照：

阳性对照的吸收值在底物反应20分钟后检测，应高于1.5（A450nm-A690nm），相当于使用1*10³细胞进行检测。如果数值较低，整个实验包括TRAP反应需重新进行。

4.3样本：

将样本的吸收值减去阴性对照的值。如果吸收值的差异（ΔA）高于0.2（A450nm-A690nm）可认为端粒酶阳性。

5.常见问题分析及解决方案

1阳性对照信号过低或无

Ø 所用热循环仪的型号不适合所设的热循环程序，选择适宜的循环条件。

Ø 引物延长、扩增所用的水含有核酸酶。必须使用无核酸酶的重蒸水（DEPC或Velcorin处理）来制备试剂。

Ø 试剂受核酸酶污染。另换阳性对照细胞提取物及样本重复全部检测。仔细检查是否污染了DNA酶及RNA酶。

Ø 孵育步骤未在300rmp振荡器下进行。选用合适的振荡器。

Ø 抗DIG-POD工作液失效，必须使用新准备的抗DIG-POD工作液，检查抗DIG-POD工作液的酶活性是否失效并准备新鲜的工作液。

2阴性对照信号过高

Ø 阴性对照、裂解试剂、或反应混合物被端粒酶阳性细胞提取物污染，以RNA酶处理或65℃热处理10分钟是阴性对照失活。重复包括扩增在内的整个实验。

Ø 阴性对照、裂解试剂、反应复合物、或其它试剂可能被以前实验的扩增产物所污染。

Ø 在检测步骤中，冲洗不充分，增加冲洗步骤。

Ø 与TMB底物溶液的孵育过长，加入TMB底物溶液20分钟内停止底物反应。