2.7.1从革兰氏阴性菌中分离高质量RNA

大肠杆菌培养物或 蓝细菌培养物

DEPC 处理的水终止缓冲液STET 裂解液酚氯仿3mol L 乙酸钠缓冲液0.2mol L 和 l0 mmol L 氧钒核苷复合物氯化铯CsCl 塾层冰冷的无水乙醇乙醇

离心机超速离心机

一 材料与设备

1)100 ml 大肠杆菌培养物或 500 ml 蓝细菌培养物。

2)DEPC 处理的水。

3) 终止缓冲液：200 mmol/LTris-Cl(pH8.0)，20 mmol/LEDTA，20 mmol/L 叠氮钠,20 mmol/LATA(aurmtrkart〕oxylicadd，Sigma)。如果 RNA 要用来作引物延伸或用于 S1 核酸酶作图. 就不要加 ATA; 缓冲液在棕色瓶屮于室温保存。

4)STET 裂解液：8%(M/V) 蔗糖，5%(V/V)TritonX100.50 mmol/LEDTA,50 mmol/LTris-Cl(pH7.0)，用 DEPC 处理的母液配制，于 4℃ 保存。

5) 酚 [用 Tris-Cl(pH8,0) 平衡]。

6) 氯仿。

7)3mol/L 乙酸钠缓冲液 pH(6.0)。

8)0.2mol/L 和 l0 mmol/L 氧钒核苷复合物

9) 酚：氯仿（1:1),

10) 氯化铯。

11)CsCl 塾层：5.7mol/LCsCl，100 mmol/LEDTA(pH7.0)

12) 冰冷的无水乙醇和 70% 乙醇。

13) 离心机，超速离心机。


二 操作方法

1) 培养 100 ml 大肠扦菌或 500 ml 蓝细菌至对数生长期，加入 1/20 体积终止缓冲液, 置于冰上

2) 于 4℃5500 g 离心 5 min 收集细胞。用 2 mlSTET 裂解液重悬细胞，加入 lO0ul0.2mol/L 的氧钒核苷复合物，移入 15 min 聚內烯管中。

3) 加人 lml 酚，振荡 lmin; 再加 lml 氯仿，振荡 Imin。于 4℃10000 g 离心 10min，收集水相。

4) 加入 1/10 体积 3mol/L 乙酸钠和 2 倍体积冰冷的无水乙醇，于 4℃10000 g 离心10min。用 2 ml0.2mol/L 氧钒核邗复合物溶液重溶沉淀。

5) 用酚：氯仿（1:1) 柚提 2 次，按步骤 4 重新沉淀。

6) 如用 BeckmanTLA-100.3 转子：重溶沉淀于 2 mlDEPC 处理水中. 加 lg 固体CsCl 并便之完全溶解，取 2.25 ml 加在 13 mm×15 mm 聚碳酸酯超离心管中的 0.75 mlCsCl 垫层之上，干 20℃280OOOg 离心 1 h, 如用 BeckmanSW-41 转子：重溶沉淀于 6 mlDEPC 处理水中，加入 4.5 g 固体 CsCl 并使之完全溶解，补加 DEPC 处理水至 9 ml. 并将其加在 14 mmX89 mmUlrradcar 超离心管中的 SmlCsCl 垫层之上，于 20°C150OOOg 离心 24 h

7) 用无菌巴斯德吸管小心地移去界面的 DNA 层，然后移去上层 CsCl 液，倾去残余液体，作记号标记 RNA 沉淀的所在，用纸巾擦干离心管壁，沉淀用 0.36lDEPC 处理水重溶并移至 1.5 ml 的微量离心管中。离心完毕后勿将离心管长久放在转子上, 应立即处理。

8) 加入 1/10 体积 3mol/L 乙酸钠和 2.5 倍体积冰冷无水乙醇，于-70℃ 沉淀 20 min, 于用微量离心机高速离心 5 min，RNA 沉淀中加人入 4℃ 用微量离心机高速离心 5 min

9) 晾干沉淀，并溶解于 200ulDEPC 处理过的水，测 A260 和 A280 定量 RNA, 最后调节浓度至 20ul./ul. 于- 70℃ 长期保存或以乙醇沉淀的形式保存。