耶鲁吴殿青组发现中性粒细胞极化新机制

　　细胞迁移是胚胎发育、伤口愈合、肿瘤转移等生命活动中的重要细胞学行为，特别在白细胞（Leukocyte）的募集（Recruitment）、转运（Trafficking）、归巢（Homing）等生物学事件中扮演着重要角色【1,2】。 细胞通过空间性重组其信号和结构分子的方式建立细胞极性（Cellular Polarity），细胞极化（Polarization）是细胞发生迁移性行为的前提条件,同时也决定了细胞迁移的方向【3】。

　　当机体局部组织出现损伤时，组织中巨噬细胞、树突状细胞等细胞会被激活而分泌细胞趋化因子（Chemokine），此外，局部组织处的血管内皮细胞也会被激活，一方面在其表面增加粘附分子（如选择素和细胞间黏附分子-1：ICAM-1）的表达，将中性粒细胞（白细胞之一）从快速流动的血液循环中抓住，使得中性粒细胞在炎性血管内表面上发生滚动；另一方面，激活的血管内皮细胞能将细胞趋化因子转运并递呈到血管腔表面并形成一定浓度梯度， 细胞趋化因子通过与中性粒细胞表面的G蛋白偶联受体(GPCRs)发生作用，发挥双重功能：（1）活化中性粒细胞的整合素信号，介导中性粒细胞与血管内皮形成牢固粘附（Firm Adhesion）；（2）诱导了细胞极化的发生，为中性粒细胞在血管表面的爬行和穿过血管进入组织提供了前提条件。

　　细胞趋化因子一方面诱导下游的小GTP酶RAC在细胞前端的活化，从而促进层状（Lamellar）的F-肌动蛋白(F-actin)在细胞前端的形成，这为中性粒细胞迁移提供动力；另一方面，细胞趋化因子信号通路也介导了小GTP酶蛋白RHOA在细胞尾端的活化。后者进一步促进了肌球蛋白轻链的磷酸化（Myosin light chain phosphorylation，pMLC），促进了肌动球蛋白（actomyosin）细胞骨架在细胞后端的形成，这位于细胞尾端的肌动球蛋白不仅为细胞移动提供推力，对于中性粒细胞在血管表面形成牢固粘附也非常重要【4,5】。

　　除了细胞趋化因子，是否还有其他的信号分子调控了中性粒细胞跨血管迁移过程中的细胞极化， 以及这些新的通路与细胞趋化因子介导的极化通路之间又有怎样的关联？这是一个非常重要的研究方向。耶鲁大学药学系吴殿青教授实验室多年来一直围绕这一问题展开研究，其早期研究发现，整合素（Integrin）信号能通过诱导中性粒细胞中PIP5K1C90 (4-磷酸-磷脂酰肌醇-5-激酶)分子的极化，并且这一极化事件不依赖于细胞趋化因子，它不仅调节RHOA分子在细胞尾部的活性和RHOA下游分子pMLC的极化以及中性粒细胞的粘附【6】。该整合素信号还决定了细胞最初极性的建立，后续发生的细胞趋化因子调控的细胞极性会遵循这一已有极性【6】。实验室进一步研究发现，极化的囊泡运输介导了PIP5K1C90的极化分布【7】。

　　3月28日，吴殿青教授实验室在Developmental Cell杂志上发表最新研究Leukocyte cytoskeleton polarization is initiated by plasma membrane curvature from cell attachment，作者们继续寻找中性粒细胞最初极化建立的调控分子。

　　他们注意到，在所有关于化学信号（细胞趋化因子或整合素信号分子）调控中性粒细胞极性的研究中，细胞都是在已经贴附到平面上（如盖玻片）的情况下接受化学信号的刺激，那细胞贴附（Cell Attachment）本身对于细胞的极化是否有调控作用？

　　研究发现，化学信号的刺激并不是引起中性粒细胞细胞骨架极化的充要条件，他们发现细胞贴附引起的形变诱导了细胞最初极性的建立。具体地，当中性粒细胞附着到平面时，接触处的细胞质膜的弯曲度（Curvature）会增加,进而招募含F-BAR结构域的SRGAP2蛋白，引起了SRGAP2蛋白及下游质膜脂质分子磷脂酰肌醇-4-一磷酸(PtdIns4P)的极化分布，从而打破了细胞的对称性。细胞弯曲度的变化诱导的上述极化事件与细胞趋化因子信号协同诱导了细胞骨架蛋白的极化。该研究揭示了细胞骨架蛋白极化起始的新调控机制。

　　首先，作者对于处于贴附和悬浮状态的中性粒细胞用细胞趋化因子（CXCL2）进行刺激，发现贴附的中性粒细胞能在前端或后端分别形成极化的F-actin 和pMLC,而处于悬浮的中性粒细胞却不能发生极化，这说明细胞贴附是细胞趋化因子诱导细胞极化所必需的。

　　作者提出假说，细胞贴附改变了细胞质膜的弯曲度，后者可能调节了细胞极化。BAR蛋白是一类含有BAR结构域的蛋白，两个BAR蛋白的BAR结构域可以形成二聚体，形成“香蕉样”的物理结构，去感应识别以及诱导不同弯曲度的细胞膜结构，该类蛋白广泛参与调控细胞内吞（Endocytosis）以及细胞突出（包括Filipodium, Lamellipodium）形成等细胞事件，BAR结构域蛋白超家族含60多个成员分子【8-10】。作者对中性粒细胞中表达的BAR分子进行siRNA功能筛选发现，BAR蛋白c成员分子SRGAP2调控pMLC的极化。SRGAP2敲除的中性粒细胞中pMLC极化异常。作者利用小鼠睾丸肌血管活体成像和小鼠心脏缺血再灌注模型发现缺失Srgap2的中性粒细胞在血管表面的粘附减少，在组织内的浸润降低。

　　作者进一步研究发现，SRGAP2蛋白的FBAR结构域在贴附的中性粒细胞中发生极化，并在液流剪切力的作用下极化到细胞的后端（相对于液流方向），并且这种极化在整合素信号和细胞趋化因子被阻止的情况下也能发生。作者还在斑马鱼急性损伤模型中观察到SRGAP2蛋白的FBAR结构域在贴附的中性粒细胞的尾端发生极化。为了测试SRGAP2蛋白的极化富集是否只决定于细胞弯曲度，作者对单个中性粒细胞采用了微管吸吮技术（Micropipette Aspiration），发现SRGAP2蛋白的FBAR结构域在吸出的细管部分发生富集而极化，并且在管子末端的富集更强，作者还改变了吸管的口径以创造出不同的弯曲度，发现弯曲度与SRGAP2蛋白的FBAR结构域极化程度呈正相关，这证实确实是细胞质膜弯曲度诱导了SRGAP2蛋白的极化。

　　作者进一步探明了中性粒细胞贴附引起细胞后端pMLC极化的机制。即细胞贴附引起了局部细胞质膜弯曲度的增加，从而招募了BAR蛋白SRGAP2分子，诱导了SRGAP2分子的极化，SRGAP2激活了PI4KA激酶的酶活力，后者催化了质膜上PtdIns4P在SRGAP2极化位置的产生从而发生极化，极化的PtdIns4P通过结合RPH3A蛋白，从而介导了PIP5K1C90-Rab21囊泡的极性运输，进而导致最终pMLC的极化。该研究表明细胞贴附本身就能诱导中性粒细胞一定形式的极化，可称之为SRGAP2极化和PtdIns4P极化，且SRGAP2或PtdIns4P的极化不依赖于细胞趋化因子或整合素的刺激。

　　本研究解析了中粒细胞极性起始的重要信号通路，揭示了空间信号（细胞形状改变）对于细胞骨架蛋白极化以及随之细胞粘附、细胞募集浸润的重要调控作用，使我们对于炎症环境下白细胞的募集的相关分子机制有新的认识，并对炎症性疾病（肿瘤或自身免疫性疾病）有重要参考价值。最后，本研究阐明了细胞贴附对pMLC极化的信号调控通路，但细胞贴附对于F-actin极化的机制还不得而知，有待下一步研究。

　　据悉，本文共同第一作者为任春光博士和袁倩颖博士，共同通讯作者为Erdem Karatekin教授、汤文文研究员、吴殿青教授。

　　参考文献

　　1. Nourshargh, S. and Alon, R. (2014) Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity 41, 694-707.

　　2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. (2007) Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews Immunology 7, 678-89.

　　3. Woodham, E. F. and Machesky, L. M. (2014) Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers. Curr Opin Cell Biol 30, 25-32.

　　4. Kolaczkowska, E. and Kubes, P. (2013) Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature reviews Immunology 13, 159-75.

　　5. Hind, L. E., Vincent, W. J., Huttenlocher, A. (2016) Leading from the Back: The Role of the Uropod in Neutrophil Polarization and Migration. Dev Cell 38, 161-9.

　　6. Xu, W., Wang, P., Petri, B., Zhang, Y., Tang, W., Sun, L., Kress, H., Mann, T., Shi, Y., Kubes, P., Wu, D. (2010) Integrin-induced PIP5K1C kinase polarization regulates neutrophil polarization, directionality, and in vivo infiltration. Immunity 33, 340-50.

　　7. Yuan, Q., Ren, C., Xu, W., Petri, B., Zhang, J., Zhang, Y., Kubes, P., Wu, D., Tang, W. (2017) PKN1 Directs Polarized RAB21 Vesicle Trafficking via RPH3A and Is Important for Neutrophil Adhesion and Ischemia-Reperfusion Injury. Cell reports 19, 2586-2597.

　　8. Simunovic, M., Voth, G. A., Callan-Jones, A., Bassereau, P. (2015) When Physics Takes Over: BAR Proteins and Membrane Curvature. Trends Cell Biol 25, 780-92.

　　9. Suetsugu, S., Toyooka, K., Senju, Y. (2010) Subcellular membrane curvature mediated by the BAR domain superfamily proteins. Seminars in cell & developmental biology 21, 340-9.

　　10. Frost, A., Unger, V. M., De Camilli, P. (2009) The BAR domain superfamily: membrane-molding macromolecules. Cell 137, 191-6.