小鼠神经干细胞的分离

实验概要

小鼠神经干细胞的分离

主要试剂

0.05% Trpsin、神经干细胞的分离溶液Ⅰ、神经干细胞的分离溶液II、神经干细胞的分离溶液III、神经干细胞培养液

主要设备

15 mL、50 mL离心管，10%FBS包被的玻璃巴斯德管，70 μm细胞滤膜，4℃低温离心机

实验步骤

（1）用10%FBS（vol/vol，DPBS配制）浸泡处理玻璃巴斯德管十分钟。把室管膜下区组织转移至15 mL离心管中，加入5 mL试剂I，用10%FBS包被的玻璃巴斯德管反复吹吸十余次将组织吹散。
！注意：吹吸组织过程中应避免产生气泡，以防止细胞生存能力降低。此步骤只适用于最多6只小鼠的组织制备。
（2）样品中加入100 μl 0.05%Tripsin，37℃温育15 min，然后用FBS包被的巴斯德管研磨十次左右，再次37℃温育15 min，再研磨十次。
！注意：一定要将组织充分消化为单细胞，否则较大的组织会被接下来的过滤操作去掉，这会导致细胞大量损失。
（3）加5 mL冰上预冷的溶液Ⅲ，用移液枪上下混匀。溶液Ⅲ中的BSA可以终止Tripsin的作用。
（4）将一个70 μm细胞滤膜放置在50 mL离心管上，然后将所有溶液通过细胞滤膜以去除残留的细胞团块，再将滤过的溶液转移至一个15 mL离心管中。4℃条件下180 g离心5 min。
（5）小心去除上清，向细胞中加入10 mL冰上预冷的溶液Ⅱ，上下吹打混匀。4℃条件下510 g离心20 min。
（6）小心去除上清，向细胞中加入2 mL冰上预冷的溶液Ⅲ。准备一个盛有12 mL冰上预冷的溶液Ⅲ的15 mL离心管，然后将2 mL细胞悬液加到上述离心管液面上。4℃条件下290 g离心12 min。