2014 年 11
月，Lancet Infect Dis
上发表了“新出现的呼吸道感染”系列文章，共
5 篇，其中第
4篇主要描述了现有的呼吸道感染病毒和细菌病原体的诊断试验，以及有望提高床旁快速诊断质量、速度和可操作性的技术发展。现将主要内容编译归纳如下。
呼吸道感染由多种病毒和细菌病原体引起，是全球发病和死亡的第二大常见病因。在全球疾病负担的排名中，下呼吸道感染仅次于缺血性心脏病位居第二。欧洲的监测报告显示，由耐药细菌所致的感染数量显著增加。社区获得性肺炎、医院获得性肺炎和通气相关肺炎不断地给临床诊断和治疗带来巨大挑战。
此外，全球广泛传播的多药耐药结核和新出现的多药耐药革兰阴性菌因缺乏有效的治疗方法而成为人们关注的重点。在日渐庞大的免疫功能低下人群中，呼吸道感染也是最常见的感染，此类人群的条件致病菌感染进一步给鉴别诊断造成困难。
只有通过快速、敏感和特异地识别病原体及其耐药谱，从而开展以循证为基础的有效抗微生物治疗和病原体特异性感染控制措施，才能在所有类型的医疗保健机构中获得呼吸道感染治疗的成功。目前已经能够利用呼吸道样本中的微生物核酸进行靶标的扩增以鉴定微生物及其耐药性。
一、临床和公共卫生诊断
当呼吸道感染患者就诊于任何医疗机构时，应同时具备诊断试验以鉴别感染是由细菌（包括结核）、病毒还是其他微生物引起的，从而获得最佳的治疗效果。目前，对于急性呼吸道感染患者，主要针对细菌感染采取经验性抗生素治疗，而非直接针对致病病原体的治疗。
现阶段，在呼吸道感染临床处理方面存在的主要问题是缺乏标准化、快速、准确、特异性的床旁诊断试验，用于筛查重要病原体、识别致病病原体和明确抗微生物药物的敏感性。当前分子技术的进步为填补这一空白提供了很好的机遇。
过去
10 年中出现了许多新的致命性呼吸道病毒和细菌，它们具有广泛传播的潜力，威胁着全球的健康安全，从而吸引了众多媒体和政府的关注。这些呼吸道病原体包括重度急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、猪流感病毒（H1N1pdm2009）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、多药耐药和广泛耐药结核分枝杆菌、泛耐药革兰阴性和革兰阳性菌、免疫功能低下患者中的耐药巨细胞病毒株和唑类耐药真菌。
其他新出现的具有流行潜力需要密切监测的呼吸道病原体包括禽流感病毒H7N9、变异型猪流感病毒
H3N2v
和 H1N1v、人腺病毒 14p1
和
C型鼻病毒。这些病毒均导致了令人担忧的局部感染暴发。
当一种既往未知的潜在致命性呼吸道感染病原体出现时，临床医生、微生物学家和公共卫生部门应通力合作，在国家和全球卫生系统的协助下应对这一威胁。
应对策略由多个部分组成：快速诊断和识别相似病例；开展病例对照研究以明确储存宿主、传播方式和危险因素；收集单个病例和聚集性病例的数据和报道；明确传播模式；分离、鉴定和描述特定病原体，如果可能的话建立柯赫法则；开发病原体特异性诊断试验和基因组测序以监测其演变和传播模式。
这些合作项目对识别特定微生物、指导合适的靶向治疗、监测治疗反应、预测预后、指导感染控制措施及制定公共卫生监测和控制推荐非常重要。公共卫生部门在处理由新的潜在致命病原体所致的呼吸道感染时，快速、准确的诊断试验是关键。
二、床旁检测和患者近旁检测
呼吸道感染对理想的床旁检测和患者近旁检测的要求相似（表 1），但根据医疗机构的需求不同可能有所差异。
多种诊断平台和试验都很有可能改善呼吸道感染的处理。而且，这些方法在应对人畜共患病原体（能够跨越物种屏障而广泛传播）所致的呼吸道感染暴发中具有越来越重要的地位。多种采用上述技术且有望大大缩短微生物感染诊断周期的商用诊断试验和平台已经上市或正在研发中（表 2）。
通常为自动化或半自动化的系统或试剂盒，整合了样本制备、病原体检测和耐药基因鉴定等步骤，并自动产生读数。这些试验和平台采用最先进的系统，在整个过程中几乎不需要用户控制，并且能够同时检测多种病原体。根据不同的试验，可以检测单个或多个病原体或耐药性。
这些系统不仅可以提供更快的诊断，还可以提高检测敏感性。然而，这些试验的开发及其在临床实践中的成功实施需要进一步研究。
虽然多重检测结果的准确性高，但为了提供诊断和流行病学信息，集中检测可能更为理想，常规的诊断实验室可以考虑履行公共卫生的职能。在繁忙的三级医疗机构、门诊或发展中国家的乡村，需要将多重分子检测移至实验室以外，作为床旁检测。
此时，一种方法的基本要求可能出现差异：对于现场研究，使用的扩增技术可能需要更适合那些供电无法保证的场合，如等温扩增。对于所有的床旁检测，操作简单便于非实验室专职人员的使用以及对原始信号数据的准确解读是关键。
三、呼吸道感染诊断方法的演变
在实验室检测诞生前，医疗实践是一门艺术，呼吸道感染的诊断主要依靠询问病史和体格检查。Antonie van Leeuwenhoek（1632-1723）发明显微镜是实验室诊断试验发展的第一步，通过痰染色镜检和痰琼脂培养（后续采用液体培养方法）进行呼吸道感染的诊断。
细菌和病毒培养方法的进一步改进提高了检测特定病原体和确定其对特定抗微生物药物敏感性的能力，但培养所需时间（24-72 h）不会影响入院时的治疗决策。这些诊断方法直至 20 世纪 80 年代晚期才发生改变，当时在分子生物学、免疫学、基因组学和技术工程领域出现了重大进展，从而诞生了许多新的诊断试验。
目前已经开发了多种诊断试验用于各种病原体，包括检测微生物抗原或抗体的血清学试验、凝集试验、补体结合试验、荧光抗体试验、放射免疫法和 ELISA。这些试验对呼吸道感染的临床处理没有显著影响。最有意义的进展是将核酸扩增技术（NAAT）用于呼吸道感染的诊断。
目前已经能够利用呼吸道样本（痰、鼻咽拭子、气道吸出物和支气管肺泡灌洗液）中的微生物核酸，对特异性遗传靶标进行扩增。该方法最初需要耗费很多劳力，目前 NAAT 技术已经发展到实时 PCR（rtPCR）、环介导扩增（LAMP）、核酸序列依赖性扩增和链替代扩增，后 3 种方法避免了热循环。
四、病毒感染的诊断试验
1. 病毒诊断方法的演变
在 NAAT 技术出现前，病毒性呼吸道感染的诊断主要依赖于血清学，包括采用补体结合试验检测抗体水平的显著升高、采用免疫荧光或比色法检测病毒抗原和细胞培养分离病毒，这些检测常常没有结果，需要通过免疫荧光或血球吸附进行二次检测。在出结果的时间并不重要的情况下，较早的病毒检测方法可能仍然有用。
在过去 20
年中，随着基因组扩增技术的发展，呼吸道病毒检测的敏感性和特异性得到了提高。目前已经发现了多种新的呼吸道病毒，而敏感的 PCR 方法在诊断流程中得以保留。技术的进步促使了多重PCR
检测的开发，该方法在一份 PCR 混合物中使用多个引物，其完成时间较多次单靶点PCR
短。
单一和多重
PCR
可以快速检测临床样本中的呼吸道病毒，并且用于确定新出现的病毒（如甲型流感 H1N1pdm2009 病毒和2012 年的 MERS-CoV）的流行病学。多重
PCR
可以在一次检测中鉴定出多种不同病毒。目前市面上已有多个多重 PCR检测方法，并且在不断地改良和评估。
病毒性呼吸道感染的基本实验室诊断方法与分型、抗病毒药物耐药性、核苷酸多态性和病毒载量检测相结合，可以为呼吸道感染的最佳治疗提供更广泛的信息。
2. 病毒诊断方法的特征
一种试验是否适用于临床取决于其相对敏感性和特异性及出结果的时间。单克隆抗体直接荧光抗体试验往往对一种特殊病毒具有足够的特异性，但需要在检测时间和敏感性之间权衡。因此，虽然一些用于直接抗原检测的比色法可以控制在1小时内完成，但敏感性约为 70%。反应化学的进一步发展促使能够在一次反应中实现对其他病毒的靶向扩增，同时维持较高的敏感性和特异性，并且检测时间仍能满足临床需要。现有的内部和商业开发的多重检测能够同时对一份临床样本中多达 20 种病原体进行扩增，但其中一些检测需要花费一整天。目前已发表了多项头对头比较内部检测试验和商用检测试验的研究。
3. 病毒多重检测的临床解读
