脉冲场凝胶电泳实验

实验概要

了解脉冲场凝胶电泳（PFGE）的工作原理，并学习和掌握有关的操作技术。

实验原理

大分子DNA(一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb)在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”)，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb  之间的DNA  片段。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA  越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA  移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE  方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE)。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE)设备能把大小范围在10～2000kb  的DNA 片段分开。FIGE也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb。

主要试剂

1. 制备DNA样品所需材料：

   1) TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA)。

   2) Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%)。

   3) EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5% Brij58；0.2%脱氧胆酸盐(Deoxycholate)；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)。

   4) ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K)。

   5) 溶葡萄球菌素(5mg/mL)。

   6) RNase(10mg/mL)。

   7) 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品)。

   8) 苯甲基横酰氟(PMSF)(17.4mg/mL于乙醇中)。

   9) 0.5μg/mL 溴化乙锭

2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料：

   1) 紫外递质。

   2) 10mg/mL tRNA。

   3) 5mol/L NaCl。

   4) 苯酚/氯仿。

   5) 3mol/L NaAc，pH5.2。

   6) 95%乙醇。

主要设备

1. Wide Mini-Sub Cell 凝胶电泳设备。

2. 变速泵或蠕动泵(Bio-Red Laboratory)。

3. IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。

4. 缓冲液冷却循环器(Fotodyne ， New Britain ，WI) 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory)。

实验步骤

1. 脉冲电场凝胶电泳的DNA样品的制备：

为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)作为例子。

   1) 取100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g 离心5min。

   2) 用20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min。之后用10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。

   3) 取1.5mL 细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque 琼脂糖的EC 缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。

   4) 对于每一个菌株，需要15～20 个凝胶块，将它们放至含有30～45μg/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的RNase)的10mL EC 缓冲液中，于37℃振摇过夜。

   5) 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50℃轻度振摇温育48h。

   6) 将凝胶块放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF)的TE 缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次)，以灭活ESP 中的蛋白酶K。

   7) 用TE 清洗琼脂块6h(2h 换液一次)，置于TE 中4℃保存。

2. 限制酶消化：

提高PFGE 的分辨率取决于100～1000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。

   1) 25μL10×反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250μL 混匀。

   2) 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求)后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。

3. 应用PFGE 对样品DNA 进行分析：

   1) 用0.5×TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用Wide Minisub Cell 进行电泳的话，50mL该溶液即可。

   2) 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。(若样品在溶液中，以l:1 的比率与50℃2%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中)。

   3) 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14℃冷却。

   4) 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速(5～10mL/rain)或打开变速泵至40。

   5) 通过计算机启动极性转换程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。小于50kb 的限制性片段在0.4s正向和0.2s 反向的电脉冲(比率为2:1)下得以分离，时间为3～5h。

   6) 在0.5μg/mL溴化乙锭中进行染色并拍照。

4. 分离、纯化大的DNA片段：

   1) 凝胶染色、分析后，在目的带前(靠近正极处)切一个6.25px²左右的槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。

   2) 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA的迁移，当目的带进入Seaplaque凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP管中。

   3) 加入2μL 的tRNA，30μL 5mol/L NaCl，370μL 蒸馏水，在65～70℃之间，化胶并保温10min。

   4) 苯酚/氯仿500μL 抽提两次。

   5) 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc(3mol/L，pH5.2)于-70℃10min 沉淀水相。再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE 缓冲液中。

注意事项

1. 换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。

2. PMSF 是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。

3. 用蛋白酶K 包埋的材料时50℃温育时间很长(24～48h)，有些学者提出如此长时间不必要(Mortimer et al.1990)，且可能造成高分子质量DNA 降解。在实验中可视情况而定。

4. 琼脂糖凝胶块在TE(pH7.6)中4℃可存放数年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。

5. 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。

6. 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14℃，需要一些冷却设备(缓冲液冷却循环器或MiniChiller)。此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。