区域特异性诱变
实验方法原理 | 可在长达3‘的克隆化DNA片段上产生大量的随机分布的核苷酸替换突变,在将DNA克隆到一个可用来分离单链DNA的载体后,用各种可造成特定碱基损伤的化学试剂处理。 |
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实验材料 | DNA |
试剂、试剂盒 | 乙酸钠 亚硝酸钠 TE 无水乙醇 dNTP 反转录酶 RNA酶 洗脱液 溴化乙锭 |
仪器、耗材 | 水浴锅 培养箱 |
实验步骤 |
1. 用限制性内切核酸酶消化DNA以获得目的DNA片段,将靶片段双向克隆到M13噬菌体载体或含有M13复制起始子的质粒载体中。从100 ml 感染细抱培养物中提取单链DNA。
3. 亚硝酸反应:在一个管内加入10 ul pH4.3的2.5 mol/l 乙酸钠和50 ul 2 mol/l 亚硝酸钠,混匀,室温温育60 min。
11. 在非变性的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳上,分离从载体上切下的目的片段,凝胶用溴化乙锭染色,切胶,洗脱出DNA。
展开 |
注意事项 |
由于不同的化学诱变剂性能差别很大,在使用前必须对影响其效果的温度、PH值、光照、溶剂等做清楚的分析,同时对其半衰期、毒性及防护也要充分了解,这样才能保证使用的有效性和人体安全性。
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其他 |
1. 由于不同的化学诱变剂性能差别很大,在使用前必须对影响其效果的温度、PH值、光照、溶剂等做清楚的分析,同时对其半衰期、毒性及防护也要充分了解,这样才能保证使用的有效性和人体安全性。 2. 当筛选方法可信度高时,往往检测方法是比较繁琐的(尤其是涉及一些蛋白质或氨基酸含量变化的突变类型)这时为了提高筛选工作量往往降低筛选的可信度,减少筛选的繁琐程度,而在复筛中进一步加以确定。
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