实验方法原理 | SELEX 技术是一种利用随机寡核苷酸(DNA 或 RNA)文库筛选靶分子的特异性配基的组合化学技术。最常用的是随机 RNA 文库,因为 RNA 分子中除 G-C、A-U 碱基对以外,还有 G-U 等变偶碱基对的存在,可以形成发夹、假结、凸环、G-四聚体等多种空间结 构,它们与靶分子通过氢键、范德华力等相互作用,或嵌合,或包被,形成稳定的复合物。 即使很小的一段 RNA 分子也能形成相当稳定的刚性结构。一个包含 25 个随机序列的随机 RNA 文库理论上可以产牛 425~1015 个具有不同空间结构的 RNA 分子,拥有巨大的筛选潜力。 |
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实验材料 | X 线胶片 可拆卸酶联板 蛋白 A sepharose 凝胶 micropure-EZ 脱酶管和 microcon-脱盐管 pGKM-T 载体 RiboMAXTM 大体积转录试剂盒 AMV 反转录酶 T4 DNA 连接酶 pfu Taq DNA 聚合酶 r Taq DNA 聚合酶 |
试剂、试剂盒 | dNTP 混合液 rNTP 混合液 DNA 凝胶洗脱缓冲液 RNA 凝胶洗脱缓冲液 SHMCK 缓冲液 封闭液 滤膜洗脱液 NT2 缓冲液 RNA 结合缓冲液 蛋白酶 K 缓冲液 |
仪器、耗材 | 电泳仪 PCR 仪 离心机 凝胶成像仪 液体闪烁仪 长波紫外灯 紫外分光光度计 核酸定量仪 pH计 培养箱 振荡器 洁净工作台 |
实验步骤 |
一、材料与设备 展开 |
注意事项 |
防止RNA酶的污染。
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其他 |
一、 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。 3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。 二、常用的RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。 5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 本实验来源《RNA 实验指导手册》主编:郑晓飞。 展开 |
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