RNA蛋白复合物中寡核苷酸靶向的RNaseH切割保护实验

蛋白酶 K AMV 反转录酶

缓冲液 DNase Ⅰ DNase Ⅰ 缓冲液 酚 氯仿溶液 乙酸钠 RNasin E.coli RNase H TBE 缓冲液 过硫酸铵溶液 尿素凝胶点样缓冲液 转移缓冲液 SSPE 缓冲液 核苷酸溶液 琼脂糖 丙烯酰胺 RNP 凝胶点样缓冲液

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 电转移设备 尼龙膜

一、材料与设备

所有的缓冲液和溶液必须无 RNA 酶污染。

1. RNP 制备和 DEAE 层析

(1) 缓冲液 D : 20 mmol/L HEPES ( pH 8.0 )，100 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA。20% 甘油，高压灭菌。在使用前加 DTT 至 1 mmol/L。加苯甲磺酰氟（PMSF）至 0.1 mmol/L。

(2) DEAE-Sepharose CL-6B ( Pharmacia 公司、Piscaraway，NJ，USA )。

(3) 缓冲液 D₁₀₀ ：20 mmol/L HEPES ( pH 8.0 )，100 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl₂，20% 甘油，高压灭菌。在使用前加 DTT 至 1 mmol/L，加苯平横酰氟（PMSF ) 至 0.1 mmol/L。

(4) 缓冲液 D₁₀₀ : 同缓冲液 D₁₀₀，但是 KCl 浓度为 400 mmol/L。

2. RNA 制备

(1) 蛋白酶 K ( PK ) : 用 dH2O 配制成 10 mg/ml 储存液，储存在 -20°C。

(2) 2X PK 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，300 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，2% ( m/V ) SDS。

(3) 无 RNase 的 DNase Ⅰ( 10 U/μl，Boehringer Mannheim 公司，Indianapolis，IN，USA )。

(4) 10X DNase Ⅰ 缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5)，50 mmol/L MgCl₂。

(5) 酚：氯仿溶液：等体积酚和氯仿混合，先用 100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 ) 进行平衡，再用 TE [ 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，1 mmol/L EDTA ] 缓冲液平衡。

(6) 3 mol/L 乙酸钠（pH 7.0 )，高压灭菌。

3. 寡核苷酸靶向的 RNase H 保护试验

(1) 与靶向 RNA 序列互补的 DNA 序列，长 12~20 nt。

(2) RNasin ( 40 U/μl，Promega 公司，Madison，WI，USA )。

(3) E.coli RNase H（1 U/μl，Bochringer Mannheim 公司）。

4. Northern 印迹和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1) TBE 缓冲液：90 mmol/L 的 Tris-硼酸盐，2 mmol/L EDTA。

(2) 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺-尿素溶液：用 TBE 缓冲液制备含 0% 和 20% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为 20：1 ) 的溶液，含 50% 尿素，过滤，室温保存在棕色的瓶子中。

(3) 用 dH₂O 配制 10% 过硫酸铵溶液。

(4) N，N，N'，N'，四甲基乙二胺（TEMED）。

(5) 尿素凝胶点样缓冲液：50% 尿素（m/V），1X TBE 缓冲液，0.05% 溴酚蓝（m/V），0.05%（m/V）的二甲苯青。

(6) 转移缓冲液：10 mmol/L Tris-乙酸盐（pH 7.8)，5 mmol/L NaAc，0.5 mmol/L EDTA。

(7) 电转移设备（Biorad 公司、Hercules、CA、USA )。

(8) 尼龙膜：采用不带电荷（Amersham 公司，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK）或者带正电荷的尼龙膜（Boehringer Mannheim 公司）能够获得好的结果。

(9) 3 MM 层析纸（Whatman 公司、Clifton、NJ、USA )。

(10) 20X SSPE 缓冲液：3.6 mol/L NaCl，200 mmol/L Na₂HPO₄（pH 7.7），2 mmol/L EDTA。

(11) Denhardt's 溶液（100X）：2% ( m/V）BSA 组分 V；2% （m/V）Ficoll 400；2%（m/V）聚乙烯吡咯烷酮。

(12) 10% SDS (m/V) 储存液。

(13) 预杂交溶液：5X SSPE 缓冲液，5X Denhardt's 溶液，0.1% SDS，50 μg/ml tRNA。

(14) ³²P 标记的寡核苷酸（1 ng/μl，1~5X10⁷ cpm/μg DNA），使用 T4 多核苷酸激酶和 [ λ-³²P ] ATP 标记 5' 末端。

5. 引物延伸

(1) AMV 反转录酶（5~10 U/μl，Promega 公司），包括 5X反应缓冲液。

(2) 含有 dATP、dCTP、dGTP、dTTP（浓度均为 10 mmol/L）的核苷酸溶液。

(3) ³²P 标记 DNA 寡核苷酸片段。

6. 自然状态下 RNP 的凝胶电泳

(1) 琼脂糖。

(2) 20% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为 80：1）溶液。

(3) RNP 凝胶点样缓冲液：0.3X TBE 缓冲液，80% 甘油，0.05% (m/V) 溴酚蓝（m/V)，0.05% (m/V) 的二甲苯青。

(4) 1.5 mm 垫片和小的垂直板凝胶的梳子。

二、试验方法

1. RNP 的制备

无论是全细胞、细胞质还是细胞核都可以制备 RNP。尽管 RNase H 切割试验可以在粗提物中成功的进行，但是这些结果的准确性有待于进一步的验证，因为相同的 RNA 可以存在于不同的 RNP 中或者以不同的构象存在，另外在粗提物中进行试验，RNP 和 RNase H 切割产物的降解也是一个严重的问题。这些潜在问题可以通过 DEAE 层析纯化 RNP 在一定程度上避免，DEAE 层析可以富集剪接体 snRNP，但是这样的处理过程给 RNA-蛋白的相互作用增加了额外的条件，比如进行高盐洗脱时许多 RNP 就被压缩成结构紧密的稳定复合物，从而影响了对它们的分析。

DEAE 层析所有步骤必须在 4°C 进行。

(1) 制备一个 5 ml 的 DEAE-Sepharose 柱，用于经缓冲液 D 透析的 50 ml 粗提物的分级分离。先用水和乙醇洗柱子，再用少量的缓冲液 D₁₀₀ 洗层析柱，用 1:1 的 DEAE-Sepharose 的 D₁₀₀ 悬液装柱，这步最好用蠕动泵进行，用 5 ml 缓冲液 D₁₀₀ 洗层析柱。

(2) 调节粗提物中 MgCl₂ 浓度至 10 mmol/L。将粗提物缓慢加入到层析柱中，注意不能让层析柱流干，用 50 ml 缓冲液 D₁₀₀ 洗层析柱。

(3) 换成缓冲液 D₁₀₀ 洗脱 RNP，收集洗脱液 15 管，每管 1 ml。

(4) 通过分析组分中 snRNP 的峰来确定蛋白质峰（通常在组分 5 和 10 之间），收集合适部分，液氮进行冷冻，储存于 -70℃。

2. RNA 的制备

要确定 RNase H 保护试验中 RNA 的保护是否是由于蛋白或 RNA 构象阻止酶接近造成的，必须用相同离子强度下去除了蛋白后 RNA 的 RNase H 切割试验作对照。进行抽提物反应和对照反应的 RNA 数量应该相等，下面步骤的量可以根据要求增加或者减少。

(1) 将 100 μl 抽提物或者 RNP 制备物与 100 μl 2X 蛋白酶 K 缓冲液（蛋白丰富的抽提物此时变得轻微浑浊）混合，加蛋白酶 K 至终浓度为 0.2 mg/ml，在 50°C 条件孵育反应液 1 h。

(2) 酚：氯仿抽提：加入等体积的酚：氯仿，振荡 10 s，16000 g 离心 2 min，将上清转移到新的离心管中，如果在两液面间有白色蛋白层，重复抽提一次。

(3) 用 3 倍体积无水乙醇沉淀 RNA，70% 乙醇洗涤，干燥沉淀。

(4) 用 89 μl 水溶解沉淀，加 10 μl DNase Ⅰ缓冲液和 1 μl DNaseⅠ，37℃ 孵育 30 min。

(5) 用等体积酚：氯仿抽提，加 1/10 体积 3 mol/L NaAc（pH 7.0）和 3 倍体积的无水乙醇进行沉淀，用 70% 乙醇洗涤，干燥沉淀。

(6) 用 100 μl 水溶解 RNA 沉淀，储存于 -20℃。

2. 寡核苷酸靶向的 RNase H 保护试验

了解 RNA 的二级结构对选择 DNA 寡核苷酸杂交链靶向序列很重要，靶向序列多位于单链区或者环状区。尽管 4 个碱基对的退火寡核苷酸作为 RNase H 切割的底物已经足够，但是高效特异配对通常需要不少于 12 个碱基对的寡核苷酸，因此最好对凭经验得 到的针对 RNA 不同序列的 DNA 寡核苷酸序列进行比较和评价。引物延伸效率可以用来选择或者检测寡核苷酸对特异 RNA 的直接结合能力。

(1) 标准 RNase 保护试验一般在 25 μl 体系中进行，体系中含有 15 μl 抽提物或者 RNP 制备物，40 mg/ml DNA 寡核苷酸，12 mmol/L HEPES（pH 8.0），60 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L DTT，20 U RNasin，1 U E.coli RNase H。对照采用相同量的相同来源的 RNA 在相同的离子条件下进行。反应液在 30℃ 孵育 60 min。

(2) RNA 片段的分析，加入 75 μl 重蒸水，100 μl 2X PK 缓冲液，4 μl 蛋白酶 K 终止反应，如前所述制备 RNA [ 2 “RNA 的制备” 中步骤 (1)~(5) ]。

(3) 如果进行 RNP 片段的分析，反应液可以直接用于下面的试验。

4. RNase H 切割产物- RNA 片段的分析

在进行 RNase H 切割以后对 RNA 片段的分析可以用 Northern blot 或引物延伸法进行分析。

(1) Northern blot

在 RNA Northern blot 分析时，探针一般选择 DNA 寡核苷酸的互补片段，它们可以特异的检测到非常小的 RNA 片段，因此在下面的操作步骤中，特殊的杂交和洗涤条件是针对寡核苷酸探针设计的。

① 变性 PAGE 凝胶电泳：安装小的垂直凝胶（17 cm X 18 cm）玻璃板，垫片厚度为 0.4 mm。

② 8% 凝胶的制备：将 10 ml 20% 丙烯酰胺/ 50% 尿素和 15 ml 0% 丙烯酰胺/ 50% 尿素储存液混合，然后加入 200 μl 10% APS 和 20 μl TEMED，混匀，立即灌胶。聚合完成以后（最少需要 3 min），用 1X TBE 缓冲液在 800V 预电泳 30 min。

③ RNA 沉淀重新溶解在尿素点样缓冲液中，上样前样品在 90°C 加热 1 min，短暂离心收集所有反应管底部的样品，取适量上样，用 TBE 缓冲液于 800V 进行电泳，直到溴酚蓝到达凝胶底部。

④ 电转移将 RNA 从聚丙烯酰胺凝胶转移到尼龙膜上，做一个夹层结构保证凝胶和尼龙膜能够紧密接触，将两个海绵垫和三张 3 MM 滤纸在转移缓冲液中浸泡，同时将凝胶和尼龙膜在转移缓冲液中进行平衡，在一个夹持器中按如下顺序放置各层，海绵垫、两层 3 MM 的滤纸、凝胶、尼龙膜、第二层 3 MM 滤纸、海绵垫，在放置时各个层之间避免出现气泡，放置好后安装到电转移装置上，加入转移缓冲液，在 4℃ 条件下，50V 转移 2 h。

⑤ 打幵夹层，尼龙膜空气干燥 10 min，用 UV 交联仪（312 nm）进行 RNA 和膜的交联，RNA 面朝向光源，用最大强度照射膜 10 min，然后在空气中使膜完全干燥。

⑥ 用杂交液在 37℃ 进行预杂交，时间不少于 2 h，然后加入 200 ng ³²P 标记的寡核苷酸探针，37℃ 杂交过夜。

⑦ 用5X SSPE，0.1% SDS 溶液洗涤两次，然后再用 2X SSPE，0.1% SDS 溶液洗涤两次，每次洗涤要在 37℃ 洗涤 15 min。

⑧ 用塑料膜完全包裹湿的尼龙膜，置于暗盒中进行 X 射线片显影。

(2) 引物延伸

① 反应：用 13.5 μl dH₂O 溶解 RNA 沉淀，加 4 μl 5X 反转录缓冲液和 1 μl ³²P 标记寡核苷酸探针（1 ng/μl），70℃ 孵育 5 min。然后在冰上孵育 5 min。

② 转录反应：在 18.5 μl 的退火反应液中加入 1 μl 10 mmol/L 的 dNTP，0.5 μl 反转录酶，42°C 孵育 45 min。

③ 加入 2 μl 3 mol/L 的 NaAc（pH 7.0）和 60 μl 无水乙醇沉淀核酸，干燥沉淀，用尿素点样缓冲液溶解沉淀，变性 PAGE 电泳分离。

④ 干燥凝胶，X 射线片显影。

5. RNase H 切割产物-RNP 片段的分析

如果发生了位点特异的切割，那么通过对经 RNase H 切割产生的 RNP 片段的分析可以了解结构域的结构，也就是蛋白的哪个部分与哪一个 RNP 亚结构域相结合。从不同的 RNP 和 RNA 中分离特定的 RNP 的试验方法包括甘油梯度离心、CsCI 密度梯度离心、RNP 非变性凝胶电泳。RNP 中的 RNA 可以釆用上面介绍的 Northern blot 或引物延伸法进行检测。下面给出的是非变性凝胶电泳分析的步骤。

(1) 安装小的垂直凝胶玻璃板，用 1.5 mm 的薄垫片。

(2) 制备丙烯酰胺溶液：12.6 ml 20% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺 80:1）、14.4 ml 50% 甘油、2.2 ml 10X TBE 缓冲液、5.8 ml 水和 0.96 ml 10% APS 混合均匀。

(3) 将 0.36 g 琼脂糖加入到 36 ml 水中，微波炉融化，等到琼脂糖温度降到大约 60℃ 时将其加入到丙烯酰胺溶液中。

(4) 加入 35 μl TEMED 混匀，立即灌胶，凝胶至少凝聚 1 h。

(5) 标准的寡核苷酸靶向的 RNase H 切割反应液加上 5 μl RNP 点样缓冲液即可以直接作为电泳样品，为了比较，将一份反应液用 75 μl 水稀释，采用前面所述的方法制备 RNA [ 2 “RNA 的制备”中步骤 (1)~(3) ]，将 RNA 溶解在 10 μl 水中，加入 15 μl 的缓冲液 D 和 5 μl RNP 点样缓冲液。

(6) 室温下用 0.3X TBE 于 60V 预电泳 30 min。

(7) 点样，在 175V （17 V/cm）电泳最少 4~5 h，直到溴酚蓝染料到达凝胶底部。由于 RNP 片段大小的变化，可能需要更长的凝胶。凝胶温度应该恒定，温度升高可能导致 RNP 的变性。

(8) 电转移将 RNP 中 RNA 从凝胶转移到尼龙膜上，转移需在 4℃ 60V 的恒压条件下进行 5 h，必须确保转移缓冲液温度不会升高，必要时使用冷凝系统，转移后的尼龙膜按以前所述的步骤进行操作 [ 4 "RNase H 切割产物——RNA 片段的分析” 中的（1）“Northern blot” 中的步骤 ④~⑦ ]。