CRISPRCas9基因编辑技术在三大热门肿瘤免疫治疗中的应用

　　基因编辑技术是对某一核苷酸序列中的特定基因位点进行人为改变，插入、删除、替换或修饰基因组中的特定目的基因使其表达性状改变的一种新兴分子生物技术。CRISPR -Cas9作为一种新兴的基因编辑技术，通过定向敲除肿瘤免疫检查点分子或者通过快速简便的基因编辑，而被广泛应用于肿瘤治疗领域，其显着降低了肿瘤免疫治疗的操作难度，同时也极大促进了肿瘤免疫治疗研究的发展。因此，本文就其在CAR-T、免疫检查点、抗体靶向疗法这三大主要肿瘤免疫疗法中的应用进行简要论述。

　　在CAR-T疗法中的应用

　　CAR-T细胞免疫疗法是多肿瘤免疫疗法中最热点的研究内容。CAR-T技术通过基因编辑获得修饰后的T细胞，能够特异性识别肿瘤细胞表面特异性受体，并增强其对肿瘤细胞的防御能力。

　　提高CAR-T细胞的制备效率

　　CAR-T疗法通过采集患者的T细胞进行基因修饰，成为CAR-T细胞后输入患者体内，过程用时长、难度高且成本大，还有T细胞自身的治疗数量限制。而 CRISPR-Cas9基因编辑技术能明显提高CAR-T细胞的制备效率，其对一个正常的免疫T细胞进行基因改造，在引入CAR序列时去除T细胞内源性αβT细胞受体基因和人白细胞抗原 I（HLA I）类编码基因，以防止用于不同患者时产生抗宿主反应。

　　提高CAR-T细胞的功能

　　CRISPR-Cas9 技术也可以通过敲除编码信号分子的基因或T细胞抑制性受体的基因来提高CAR-T细胞的功能。

　　CAR-T细胞疗法的抗肿瘤疗效显着，但只能够特异性识别肿瘤细胞表面受体，而肿瘤特异性T细胞受体（TCR-T）细胞能够通过基因修饰表达特异性受体，识别肿瘤细胞表面经I类主要组织相容性抗原呈递的抗原肽从而识别胞内特异性分子。但受体T细胞中存在的内源性TCR与修饰后的TCR可能会存在竞争反应，因此采用CRISPR-Cas9 基因编辑技术制备TCR、HLA I 类分子和PD1缺失的CAR-T细胞，使其异体反应降低又不引起抗宿主疾病，体内抗肿瘤疗效也得以提升。

　　其还能通过敲除免疫共抑制通路或信号分子的基因（如CTLA4、PD1）提高CAR-T细胞的功效。

　　科学家运用CRISPAR-Cas9 技术有效地对CAR-T细胞进行基因编辑，得到多基因敲除CAR-T细胞，防止免疫调节物对 T细胞活化与增殖的影响，成功提高CAR-T细胞对免疫细胞的防御作用，更好地发挥抗肿瘤疗效。

　　NIH（美国国立卫生研究院）下属Recombinant DNA Advisory Committee批准的由Carl June教授领导的一项CRISPR临床试验。在该试验中，研究人员将利用CRISPR-Cas9在靶向黑色素瘤的CAR-T中敲除编码PD-1的基因以及内源性T细胞受体的基因，敲除PD-1之后，CAR-T的杀伤性更强。

　　2017年12月，中国科学院王皓毅团队在Frontiers of Medicine上发表了一篇名为CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells的文章，该研究团队建立了利用CRISPR-Cas9系统在T细胞或CAR-T细胞中高效敲除LAG-3基因的方法，其发现敲除LAG-3的CAR-T细胞能够维持抗原特异性细胞因子释放和体内外抗肿瘤功能。

　　美国斯隆凯特林癌症纪念中心的研究人员利用CRISPR-Cas9技术运送CAR基因到T细胞基因组中的特定位点上，利用这种方法构建出更加强效的CAR-T细胞。而这些CAR-T细胞不容易耗竭，能够长时间地持续发挥抗肿瘤作用。

　　来自圣路易斯华盛顿大学医学院的科学家们利用基因编辑技术CRISPR对人类T细胞进行了改造，去除了CD7和T细胞受体α链(TRAC)表达，这是一种针对CD7+ T细胞恶性肿瘤，避免了“自相残杀”的CAR-T细胞疗法(UCART7)。其在保护正常T细胞的情况下，对癌性T细胞发起攻击。其研究结果显示：接受基因编辑改造的以CD7为靶点的T细胞治疗组的小鼠，中位生存期为65天，而接受对照组小鼠的中位生存期仅有31天。研究结果于发表在权威学术期刊Nature子刊Leukemia上，

　　CRISPR技术在CAR-T细胞的基因修饰方面的应用，具有广阔的应用前景。但目前还存在两个限制性问题：

　　CRISPR技术导入T细胞的方法不能使普通细胞正常增殖，限制了细胞培养和富集过程。导入方法中，非整合转染方法虽安全但效率低，整合转染的方法效率较高但其安全性不能保证。

　　CRISPR编辑系统存在脱靶现象，一旦发生脱靶，将导致非靶标基因的改变或调控元件的破坏，会造成不可逆转的后果。因此CAR-T细胞的精确编辑和高效导入是基因编辑技术未来主要的研究方向。

　　在免疫检查点中的应用

　　PD-1和CTLA-4是如今十分熟知的免疫检查点，能显着抑制T细胞的活性，进而使得肿瘤细胞易于逃逸机体免疫机制，导致T细胞治疗效果较差。目前为了更好发挥T细胞肿瘤治疗的疗效，利用免疫检查点抑制剂的阻断抗体是常用的阻断免疫调节物对T细胞的免疫应答抑制有效方法。

　　其中通过CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲除参与免疫负调节的基因，也能达到同样的抗肿瘤效果，是一种全新的治疗思路。利用电穿孔方法将Cas9和sgRNA导入T细胞并敲除PD-1基因，使其表达减少，长时间的体外培养过程中没有发现PD-1对T细胞活化的影响，使T细胞更好地发挥其抗肿瘤疗效。这种新的阻断疗法常常与过继性T细胞免疫疗法结合使用，可以增强免疫细胞的活性。

　　CAR-T领域的先驱者Carl June教授在Clinical Cancer Research杂志上发表的文章证实，体外和动物模型研究中，用CIRSPR技术敲除TCR和B2M这两个和免疫排除有关的基因后，T细胞同种异体反应性降低，且没有导致GVHD。

　　此外，中国和英国科学家也发现，用CRISPR敲除TRAC （T cell receptor alpha constant chain）后可以构建的通用型CAR-T。

　　同时，这些进展表明了利用靶向基因编辑技术敲除免疫检查点已是改进CAR-T治疗实体瘤非常有希望的策略。

　　在抗体靶向疗法中的应用

　　肿瘤细胞表面表达了与正常细胞不同的抗原，而这些抗原可以作为单克隆抗体识别的靶点，被抗体识别并结合，引起肿瘤细胞的死亡，从而达到抗肿瘤的目的。目前，FDA已批准的许多抗体类药物，如抗HER2抗体、抗CD20 抗体、抗VEGF 抗体等。

　　鉴定肿瘤细胞表面的潜在特异性靶点

　　CRISPR-Cas9 基因编辑技术可以用来鉴定肿瘤细胞表面的潜在特异性靶点，进一步发展抗体的靶向治疗应用。Steinhart等利用CRISPR-Cas9技术在具有RNF43 突变的胰腺导管肿瘤细胞之间进行全基因组筛查，发现Frizzled-5受体在胰腺肿瘤细胞的生长中起着关键作用。特异性结合Frizzled-5的抗体能够明显抑制荷瘤小鼠中癌细胞的增加。

　　近日，来自耶鲁大学的陈斯迪研究团队开发出筛选CD8+T细胞上与肿瘤免疫治疗相关基因的CRISPR系统，并找到与肿瘤浸润相关以及发挥CD8+ T细胞毒性杀伤的关键基因，其发现名为DHX37基因能抑制CD8杀伤T细胞对小鼠肿瘤的反应，敲除CD8+ T细胞中该基因后，CD8+ T细胞在体内具有更强的肿瘤杀伤能力。

　　抗体的制备

　　另外，CRISPR-Cas9 不仅可以鉴别肿瘤细胞表面特异性靶点，同时也在抗体的制备中发挥着作用。根据抗体重链C区氨基酸组成不同，对应的抗体可分为IgG、IgA、IgM、IgD 和IgE五类，在激活补体系统、激活效应细胞以及对靶细胞的杀伤作用方面这五类抗体均存在差异，在肿瘤的抗体靶向治疗中也起着不同的作用。因此，抗体类型转换使抗体多样化，更多地应用于抗体的靶向治疗。B细胞特异性胞苷去氨酶（AID）参与了抗体类别转换的过程，Ig基因发生类别转换最重要的步骤是DNA双链的断裂，断裂一般是由B细胞特异性酶如重组激活基因蛋白 1/2（RAG 1/2）和AID启动。

　　研究者们运用 CRISPR-Cas9技术编辑人类和小鼠的Ig基因，利用CRISPR-Cas9介导的IgM+小鼠B细胞、杂交瘤细胞及人的B细胞重链恒定区基因高效DNA断裂，故发生类转换重组，实现IgM-IgG-IgA 的抗体类型转换。通过CRISPR/Cas9 技术，可靶向编辑杂交瘤细胞或者B细胞免疫球蛋白重链恒定区的基因，获得特定类别的抗体，达到抗肿瘤的目的。

　　抗体的抗原结合片段（Fab）分子量小，更易渗透进入肿瘤组织，在肿瘤的抗体靶向治疗中起着关键作用。因此有研究了获得只分泌抗体 Fab 片段的杂交瘤细胞，利用CRISPR-Cas9 技术删除小鼠杂交瘤细胞的Fc段的基因，便可以更为高效简便地获得抗体的Fab片段，并易与其他药物偶联进而渗透入肿瘤组织，抗肿瘤效果更为显着。

　　结语

　　由于CRISPR-Cas9技术操作过程中存在脱靶效应以及细胞内递送效率低的问题，其在临床治疗上的应用存在限制，如何在不影响CRISPR-Cas9 的简便性和高效性的同时又可以有效地降低其脱靶效应发生率，提升其对免疫细胞的转染效率，达到理想的抗肿瘤免疫治疗效果，这也将是科学家们继续努力的方向。

　　但不可否认的是CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤免疫治疗中担任着越来越重要的角色。随着该技术进行进一步的完善，将会使其更加广泛地应用于基因研究，同时促进抗肿瘤免疫的临床治疗。