一、原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶,它催化下列反应:
2O +2H →H O +O
本反应产物H O 可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、 仪器 设备及试剂
(一)材料
水稻或小麦叶片。
(二) 仪器 设备
高速台式离心机,分光光度计,微量进样器,荧光灯(反应试管处照度为4000lx),试管或指形管数支。
(三) 试剂
(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。
(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。
(3)750µmol/L氮蓝四唑溶液:称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。
(4)100µmol/LEDTA-Na2溶液:称取0.03721g EDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000ml。
(5)20 µmol/L核黄素溶液:称取0.0753g核黄素用 蒸馏 水定容至1000ml,避光保存。
三、实验步骤
1、酶液提取
取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的 研钵 中,加1ml预冷的磷酸 缓冲液 在冰浴上研磨成浆,加
缓冲液 使终体积为5ml。取1.5-2ml于1000r/min下离心20min,上清液即为SOD粗提液。
2、显色反应
取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下表加入各种溶液:
各溶液显色反应用量
混匀后将1支对照管置暗处,其他各管于4000lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高,时间缩短,低时延长)。
3、SOD活性测定与计算
至反应结束后,以不照光的对照管作空白,分别测定其他各管的吸光度。
四、结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。
SOD总活性=
SOD比活力=
式中:SOD总活性以鲜重酶单位每克表示;比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;A 为照光对照管的吸光度;A 为样品管的吸光度;V为样品液总体积ml,V 为测定时样品用量ml;W为样鲜重g;蛋白质含量单位为mg/g。
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