贴块法
实验方法原理 | 首先建立家兔椎间盘细胞的体外培养系统,其中,第一组给予纯氧,另外3组给予不同浓度的臭氧:30 ug/ml,60 ug/ml和80 ug/ml,然后于15 min及30 min后,采用台盼蓝细胞排斥试验计算椎间盘细胞的活细胞率。 |
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实验材料 | 家兔 |
试剂、试剂盒 | 培养液 DMEM Hanks’缓冲液 胎牛血清 胰岛素 转铁蛋白 亚硒酸盐 青霉素 链霉素 |
仪器、耗材 | 培养皿 培养瓶 烧瓶 试管 眼科剪、眼科镊 CO2 培养箱 pH 计 恒温水浴 |
实验步骤 |
一、实验步骤 1. 组织块贴块法
(1)取材:空气栓塞法处死家兔后,在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM 培养基(含双抗)。迅速带回到无菌超净台上。
(3)接种:用吸管吸取小组织块入培养瓶底部,摆放均匀,一个25 cm2 的培养瓶可放置10-15 个小组织块,翻转培养瓶,加入少量培养液。4~6 小时后,待组织块充分贴壁后,再翻转回来(动作一定要轻巧, 以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底)。
(4)于5% CO2 孵箱中培养,每隔 3 天换液。待细胞 95%融合时,0.25%胰蛋白酶传代分瓶。
2. 酶消化法
(1)前面步骤同组织块贴块法 1、2。 二、结果 IVD 细胞为类软骨细胞,描述:单层细胞形状不规则,可呈三角形、多角形,梭形及不规则形。不同于成纤维细胞。如下图:
图1:组织块贴块法
图2:传代细胞形态
图3:细胞传代前状态95%融合
展开 |
注意事项 |
椎间盘位于相邻两个椎体之间,取材过程较为繁琐, 要求动作迅速,争取在家兔死后半小时内完成,否则,该组织对缺氧耐受性差导致培养失败。
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