DNA甲基化研究方法的回顾与评价(图)

摘要： DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。本篇将主要介绍目前存在的大部分DNA 甲基化研究方法，并对其相关特性进行了简要分析与总结。

关键词 ：表观遗传学；DNA 甲基化；甲基化研究方法

早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R.Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA 和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA 甲基化最为常见。继人类基因组计划结束后，2003年人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium,HEC)宣布开始投资和实施人类表观基因组计划(HEP)。

其主要任务是绘制出人类中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA 甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA 甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我们一一介绍现有的大部分DNA 甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。

1导言

1.1 DNA 甲基化及CpG岛

DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA 甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA 的甲基化是在DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA 修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。

哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛[5]。通常，CpG岛大约含有500多个碱基。

在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化[6]，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区[7]。健康人中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留[8]。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失[9]。

1.2 DNA 甲基化的生物学作用

1.2.1 DNA 甲基化与遗传印记、胚胎发育

DNA 甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于DNA 适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome,BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[10]。

1.2.2 DNA 甲基化与肿瘤

甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)[4]和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高,例如：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因印记丢失导致多种肿瘤,如Wilm‘s瘤[11]。

目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关[12]。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测[13]，而且全的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著[14] ,因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级。

Shinichi Toyooka描述了肿瘤发生与异常甲基化的关系：被SV40 (Simian Virus 40)感染的人间皮细胞，其端粒酶活性上调，Notch-1基因表达增加，肿瘤相关基因（包括抑癌基因RASSF1A）的启动子区发生异常甲基化[15]。Cui等发现部分结肠癌患者的正常肠粘液腺细胞的IGF-2基因印记丢失[16]。Uhlmann等发现不同病理类型及不同恶性程度的神经胶质瘤细胞的7种肿瘤标志基因存在着不同程度的甲基化 [17]。因此，甲基化的研究，为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据 。

1.3 DNA 甲基化的研究方法

近15年来，人们越来越认识到DNA 甲基化研究的重要性，开发出一系列检测DNA 的方法。根据研究目的这些方法分为：整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。Christina Dahl和Per Guldberg[3]归纳总结了主要的甲基化分析方法及相关特性，在此基础上我们略加以补充（见表1）。