一、原理
还原型抗坏血酸(AsA)可以把铁离子还原成亚铁离子,亚铁离子与红菲咯啉(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉,BP)反应形成红色螯合物。在534nM波长的吸收值与AsA含量正相关,故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸(DAsA)可由二硫苏糖醇(DTT)还原成AsA。测定AsA总量,从中减去还原型AsA,即为DAsA含量。
二、仪器与用具
三、试剂
5%三氯乙酸(TCA);20%TCA;无水乙醇溶液;0.4%磷酸-乙醇溶液;0.5%BP-乙醇溶液;0.03%FeCl3-乙醇溶液;0.6g/L DTT;Na2HPO4-NaOH溶液:以0.2mol/L Na2HPO4和1.2mol/L NaOH等量混合;60mmol/L DTT-乙醇。
四、方法
1. 制作标准曲线配制浓度为2mg/L,4mg/L,6mg/L,8mg/L,10mg/L,12mg/L,14mg/L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1.0ml于试管中,加入1.0ml 5%TCA、1.0ml乙醇摇匀,再依次加入0.5ml 0.4%H3PO4-乙醇、1.0ml 0.5%BP-乙醇、0.5ml 0.03%FeCl3-乙醇,总体积5.0ml。将溶液置于30℃下反应90min,然后测定A534。以AsA浓度为横坐标,以A534为纵坐标绘制标准曲线,求出线性方程。
2. 提取取植物叶片1.0g,按1∶5(W/V)加入5%TCA研磨,4000r/min离心10min,上清液供测定。
3. 测定
(1)AsA测定取1.0ml样品提取液于试管中,按上述相同的方法进行测定,并根据标准曲线计算AsA含量。
(2)DAsA测定向1.0ml样品液中加入0.5ml 60mmol/L DTT-乙醇溶液,用Na2HPO4-NaOH混合液,将溶液PH调至7~8,置于室温下10min,使DAsA还原。然后加入0.5ml 20%TCA,把PH调至1~2。按AsA相同方法进行测定,计算出总AsA含量,从中减去AsA,即得DAsA含量。
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