58. 用 1：10 000 的 SYBR Green I 染 15 min。在 UV 盒上观察，分出感兴趣的区带。
59. 把每一块凝胶放入底部有约 0.5 mm 小洞的 0.5 ml 微量离心管中（用 21-G 针头刺的）。
60. 把 0.5 离心管连同凝胶块放入 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 2 min， 把聚丙烯酰胺凝胶打碎成小块，收集在 2.0 ml 的管底。
61. 扔掉 0.5 ml 的离心管。2.0 ml 离心管中加入 300 ul LoTE 缓冲液。涡旋每个管子，然后置于 37°C 15 min。
62. 把每个管里的东西转移到 2 个 Spin-X 的离心管滤膜上（总共 4 个 Spin-X 管子）， 最高速离心 5 min。
63. 每两个 Spin-X 管子的洗脱液合并在一个 1.5 ml 离心管中，加入乙醇进行沉淀：
300 ul 洗脱液
2 ul SeeDNA
133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵
1000 ul 100% 的乙醇
64. 最高速离心 15 min。70% 乙醇洗两次，晾干 5 min。纯化的串联 DNA 重悬于 6 ul LoTE 缓冲液。
65. 在10 ul 的体系里，用 SphI 消化 1 ug pZErO-1 质粒：
1 ul pZErO-1 质粒
7 ulddH2O
1 ul 10×NEB 缓冲液 2
1 ul SphI
37°C 温育 15～30 min, 然后 65°C 加热 10 min 灭活。不要消化超过 30 min。
66. 琼脂糖凝胶电泳检查消化是否完全。用 90 ul pH 8.0 的 TE 稀释切好的载体，然后用等体积 PC8 抽提。乙醇沉淀，75% 乙醇洗涤 2 次，重悬于 40 ul 水或 TE 缓冲液中（约 25 ng/ul 载体）。
67. 混合下面的连接反应液，同时配制一份不加串联体的对照反应：
6 ul 纯化的串联体（对照中不加）
1.5 ul dH2O （对照中 7.5 ul）
1 ul 25 ng/ul SphiI 切好的 pZErO 质粒
1 ul 10×T4 DNA 连接酶缓冲液
0.5 ul 4 U/V 的 T4 DNA 连接酶
16°C 温育 2 h。
pZErO质粒的厂商提醒如果温育时间长于 1 h 会使背景增高，原因可能是 ccdB 死亡基因上自然发生的突变。
68. 用 LoTE 缓冲液把样品调整到 200 ul 用等体积的 PC8 抽提，然后乙醇沉淀：
200 ul 样品
133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵
2 ul SeeDNA
777 ul 100% 的乙醇
69. 70% 乙醇洗 4 次。最高速快速离心，弃去 70% 乙醇，晾干 5 min。重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。
70. 把所需数量的 0.1 mm 的微电击杯和 1.5 ml 的离心管置于冰上。
71. 在合适数量的 15 ml 培养管里加入 1 ml SOC 培养基，置于室温。
72. 往冰上的 1.5 ml 离心管中加入 1 ul 步骤 69 中的 DNA 。在一个标有「对照」的管 里加入 1 ul 0. 01 ng/ul 的 pUC19 对照DNA，用作转化效率的测定。余下的 DNA 保存在 -20°C。
73. 从 -70°C 移出 DH10B 电转感受态细胞，置于冰水上，当细胞融化后，轻弹管子混匀细胞。
74. 每个冷的含 DNA 1.5 ml 的离心管里加入 40 ul 感受态细胞。未使用的细胞用干冰/甲醇重新冻起来，然后放回 -70°C。
75. 把 40 ul 细胞/ DNA 混合物加入到一个预冷的一次性微电击杯中。用 Bio-Rad 基因脉冲电转仪在 100 Ω/25 uF/1.8 kV 的条件下进行电转。
76. 把电转过的细胞转移到一个 15 ml 的培养管里，马上加入 1 ml 室温的 SOC 培养基。37°C，225 r/ min 摇动 15 min。
作者发现涂板前先培养 15 min, 能使转化效率达到 1.0×1010 cfu/ug pUC19。
77. 1 : 100 稀释用 pUC19 电转的对照细胞，取 100 ul 涂在含 100 ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上。
78. 每个 10 cm 的含 zeocin 的低盐 LB 平板上涂 1/10 转化的细菌。培养 12～16 h 后分析。如果插入片段大小合适的话，每个串联反应的 10 个平板都要保存，以备以后测序。
79. 用 50 ul 的 PCR 反应检查插入片段的大小。配制反应混合液（下面的体积乘以总样品个数加上 1 或 2 以防吸量损失）：
2. 5ul 10×SAGE PCR 扩增缓冲液
1.25 ul DMSO
1.25 ul 10 mmol/L dNTP
0.5 ul 350 ng/ul M13 正向引物
0.5 ul 350 ng/ul M13 反向引物
43 ul ddH2O
0.75 ul 10 : 1 U 的 Taq:Pfu DNA 聚合酶
96 孔板的每孔中加入 50 ul 混合液。
80. 用无菌的牙签或吸头轻轻挑起克隆然后把头放入 PCR 混合液里搅动几下。
81. 用热循环仪执行下面的扩增程序：
1 轮：
2 min 95°C
25 轮：
30 s 94°C （变性）
1 min 55°C （复性）
2 min 72°C （延伸）
1 轮：
5 min 70°C （终产物延伸）
基于 Taq DNA 聚合酶的 PCR 扩增，0. 5～1 min/kb 的模板扩增延伸时间就足够了，与此相反，基于 Pfu 的 PCR 扩增，至少 1～2 min/kb 才能达到类似的合成效率。
82. 取 4 ul 在 1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳，电压约 150 V。
大规模筛选时，使用多通道移液器和 Owl Centipede 50 孔的水平电泳系统。多通道移液器的吸头 和 Owl Centipede 配备的 50 齿的梳子正好合适（每隔 1 孔）。因此为保持每个 96 孔板的连续的点样顺序，需要另外准备一块装有上样染料的 96 孔板。
