植物蛋白质组学和糖基化实验（一）

实验材料 链霉亲和素-过氧化物酶牛胰核糖核酸酶 B甲基比喃甘露糖苷卵清白蛋白

试剂、试剂盒 DIG 糖链检测试剂TTBS 缓冲液Lectin- biotinTBS 缓冲液

实验步骤

3.1 这个蛋白质是糖蛋白吗

只有一种方法能全面的回答“这个蛋白质是糖蛋白吗?”这个问题。这需要使用能检测并定量印记上糖蛋白的总糖检测试剂盒。Roche  Applied  Science 公司商业出品----DIG 聚糖检测试剂盒（产品包含使用说明）提供了这些测定所需的试剂。需要指出的是，在使用这个试剂盒时，蛋白质至少结合有一个糖苷部分才能获得实验结果，这些检测无法提供参与糖基化的寡聚糖分子的类型和其与蛋白骨架连接的相关信息。

3.2 蛋白质是怎样被糖基化的

有几种方法可以用来进行糖蛋白上糖苷特性的鉴定，一种方法包括应用糖蛋白寡糖部分的特异性探针的 Western印迹实验，这种探针有凝集素型和抗体型两种类型。这个方法既不需要进行糖蛋白样品的纯化，也不需要糖苷的解离或分离（见 25. 3. 2 节 1.1)。另一种方法是分离糖蛋白，直接分析与糖蛋白连接的糖苷的单糖组成（见 25.  3.2 节 2.1)。还有一种方法是经化学或酶学处理，将纯化获得的糖蛋白上的糖苷选 择性解离下来。接着通过电泳或质谱对去糖基化之前或之后的糖蛋白进行分析（见 25. 3. 2 节 2.1)。选择性裂解会为我们带来与糖蛋白连接的糖苷的特性。与此同时，通过质谱鉴定到的蛋白分子质量的差异将为我们提供与糖蛋白连接的糖苷的结构信息。

1. Western 印迹检测糖苷的方法

一维或二维电泳胶的 Western 印迹可用来检测糖蛋白上糖苷。用于这种检测的探针大多具有 N- 连糖苷特异性。

1 ) 凝集素亲和检测

凝集素是一类可与寡聚糖部分特异结合的植物蛋白质，它们已被鉴定出具有对哺乳动物糖蛋白的亲和性，这些凝集素列于表25-1 中，其中只有一少部分可用于植物糖蛋白的检测（见注释 2) 。

这类凝集素商品是凝集素-生物素化形式。通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶标识物，辨别凝集素和寡糖。但是，唯有刀豆球蛋白 A 例外，因为它可直接结合到过氧化物酶上。下面是这两种方案的具体内容：

凝集素- 生物素/链霉亲和素-过氧化物酶方法：

( 1 ) 通过 1D 或 2D 电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。

( 2 ) 用 TTBS 缓冲液浸泡印迹膜 1 h ( 见注释 3) 。

( 3 ) 将印迹膜在含有凝集素-生物素复合物（0.1 mg/20 ml) 的 TTBS 缓冲液中，室温下浸泡 2 h。

( 4 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗 4 次，每次 15 min。

( 5 ) 将印迹膜在以 1：1000 稀释在 TTBS 缓冲液中的链霉亲和素-辣根过氧化物酶标物中，室温下温育 1 h。

( 6 ) 在 TTBS 缓冲液中漂洗印迹膜 4 次（每次 15 min) ，显影前在 TBS 溶液中漂洗一次。

( 7 ) 在一个烧杯中将 30 mg 4-氯-1- 萘酚溶解在 10 ml 冷甲醇中（一20℃），在另一个烧杯中的 50 ml TBS 缓冲液中加入 30 μl H2O2。在要显影印迹膜时，合并上面这两个烧杯中的溶液，配制成过氧化物酶显影混合液（要现用现配），轻轻摇动来优化显影反应。

( 8 ) 倒掉显影混合液，并用蒸馏水漂洗印迹膜数遍，终止显影反应。晾干印迹膜，夹在两层滤纸之间保存。

( 9 ) 实验对照，请见注释 4 。