ELISA法检测肿瘤坏死因子

肿瘤坏死因子(TNF)是由激活的单核细胞巨噬细胞受内毒素刺激后产生的一种分子量为17 000的蛋白质。其中，由巨噬细胞产生的称TNF-α，是巨噬细胞介导细胞毒效应的细胞因子；由淋巴细胞产生的称TNF-β。TNF在体内具有广泛的生物学活性：可作为免疫应答中的一种中间介质，既有抗病效应，又有致病效应；可引起肿瘤的出血坏死；可刺激成纤维细胞增殖；可增加HLA-A、HLA-B、HLA-C抗原的表达；可激活中性粒细胞及杀伤细胞；可促进B细胞增殖及分化、增加IL-2受体表达。肝脏是TNF的主要发源地，同时也是TNF清除的主要部位。目前，以TNF-α在临床的意义较大，是内毒素引起肝损害的重要介质。TNF-α只有通过与靶细胞表面的膜型受体(mTNF-aR)特异结合才能发挥毒性效应，这一结合过程又
受血清中可溶性TNF-α受体(sTNF-aR)的调节和制约，而sTNF-aR可与mTNF-aR竞争结合TNF-。。临床上常以检测TNF-α为主。
[检测方法] ELISA法
[方法学原理] 在微孔反应板上包被抗人TNF-α单克隆抗体，待测标本和标准品中的TNF-a会与单克隆抗体结合，游离的成分被洗去，同时加入生物素化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异结合，抗人TNF抗体与结合在单克隆抗体上的人TNF-α结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有TNF-α，HRP会使无色的显色剂呈现蓝色，加终止液变黄色。在波长450nm处测吸光度，TNF浓度与吸光度成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的TNF-α浓度。
[标本准备] 静脉血2ml，不抗凝。
[试剂]
1．预包被微孔反应板
2．浓缩酶结合物
3．酶结合物稀释液
4．标准品和标本稀释液
5．浓缩生物素化抗体
6．IFN标准晶
7．浓缩洗涤液
8．显色剂A、B
9．终止液
[仪器] 酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。
[检测步骤]
1．在微孔反应板相应孔中分别加入待测样本、不同浓度标准品100txl，再加生物素化抗体工作液50tzl。
2．振荡混匀，置20-25℃环境中温育120min。
3．将孔内液体吸干，用洗涤液充分洗涤5次，干燥。
4．除空白孔外，加入酶结合物工作液100u1。
5．振荡混匀，置20-25℃环境中温育30min。
6．将孔内液体吸干，用洗涤液充分洗涤5次，干燥。
7．每孔加入显色剂A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37C环境中避光显色10min。
8．加入终止液50ul后，轻轻振荡混匀。用酶标仪(450nm波长)测定各孔吸光度，与标准曲线对照，求出TNF值。
[正常参考值] 各实验室可根据检测方法的不同确立正常参考值。
[注意事项]
1．试剂盒从冷藏环境中取出时应在室温环境中平衡30min后方可使用，未用完的微孔条用自封袋密封保存。
2。酶标板洗涤时各孔均需加满洗涤液，防止孔内有游离酶不能洗净。应设定30～60s的洗涤浸泡时间。
3．滴加试剂前应将滴瓶翻转数次，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。
4．所有样品和废弃物都应按传染源处理。终止液为2mol／L硫酸，使用时应注意安全。
5．每批样本应同时做标准曲线。
6．若标本OD值在标准曲线测定范围以外，应适当稀释后重测。
[临床意义] 类风湿关节炎、多发性硬化、恶性肿瘤、器官移植患者血清TNF升高。