一、关于血清使用的几点建议:
1、血清必须贮存-20℃,如存放于4℃,请勿超过两周,对于某些单位一次无法用完一瓶,可在无菌条件下将其40-45ml分装于无菌50ml离心管中(或血清瓶中),由于血清解冻时体积会增加10%,必须预留此膨胀体积的空间,否则易发生污染或容器冻裂的情形。
2、一般公司所提供的血清一般为200ml和500ml装量,因此建议在使用中宜采取逐步解冻的方法解冻血清:-20℃→4℃冰箱或冷库溶解24小时→室温下全溶后再分装,一般以50
ml无菌离心管中分装40-45ml。使用过程中要特别注意,必须规则地将血清摇晃均匀,小心勿造成气泡,使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由
-20℃放置至37℃环境下解冻,因为温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而产生沉淀。
3、血清的灭活(heat-inactivation)一般是指56℃,30分钟水浴加热已完全解冻的血清,加热过程中必须规则地摇晃均匀。此处理的目的是使血清中的补体成分(complement)去活化。但是,经过灭活处理的血清会因而造成沉淀的显著增多,且会影响血清的品质。所以,有的公司所生的细胞培养用牛血清不做灭活处理,由客户自行选择。而诊断试剂用血清在除菌过滤前进行过灭活处理。
4、在使用血清的时候,勿将血清留置于37℃太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分会因而受到破坏,影响血清的品质。
5、一般我们在使用过程中是先过滤培养基,再加血清,勿直接过滤血清。
6、血清的沉淀物:
(1)凝絮物:其产生的原因有多种,但普遍的原因是血清中的脂蛋白(lipoprotein)变形及解冻后血清中存在的纤维蛋白(fibrin)造成,这些凝絮沉淀物不会影响血清本身的品质。除非必须,如果您想减少这些沉淀物,建议可用离心3000rpm,5min去除,或离心后取上清液加入培养基中一起除菌过滤。
(2)显微镜下观察“小黑点”,通常经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为是血清遭受污染(如黑胶虫),而将血清放置在37℃中欲培养此“微生物”,但37℃环境下,又会使此沉淀物增多,更会误认为微生物的增殖,但以培养细菌的培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点不会影响细胞的生长。
二、血清质量的决定因素:
1、关于牛种:
血清质量与牛种没有必然的联系,但有其先天条件。
首先,澳大利亚、新西兰的牛源之所以被国际公认为最好,原因是这些国家的牛源是“无污染”的,“无污染”的实际含义是:病毒等外源因子污染较少。至于美国,由于其国内出现了疯牛病,其形象由此受到挑战。这种血清安全性的观念在发达国家认知度较高,而在我国还不够重视。其次,牛所能获得的营养对血清质量有影响。在我国,由于饲养条件的不同,不同地区产的血清质量是有差异的。
2、质量标准件的问题:
我国对人用生物制品生产所用的牛血清制定了国家标准,载于《中国生物制品主要原辅材料质控标准》2000年版,此标准已接近于国外胎牛血清的有关标准。内毒素:国家标准件为不高于10Eu/ml,内控标准件为不高5Eu/ml或10Eu/ml。国家标准之外的质控指标还有:免疫球蛋白、牛腹泻病毒
(BVDV)抗体、激素、和牛源安全性验证等。
3、牛血清的命名和选择:
一般公司对细胞培养用牛血清的命名分二类:胎牛血清和小牛血清。对于一般的细胞系,小牛血清可以培养得很好。
三、关于牛血清白蛋白的生产工艺:
牛血清白蛋白的制备方法有Cohn's法、盐析法、热变性法等多种工艺。不同的生产工艺其产品的名称、质量指标、应用领域等各不相同。
其中Cohn's法设备、工艺要求比较高,相对应的生产成本较高,但产品质量较好。牛血清组份V(FrationV)就是由Cohn's法制备的。一般白蛋白纯度96-99%、外观洁白、结晶性状好、1%蛋白水溶液PH7.0±0.2,再根据不同的应用分成低内毒素、低脂肪酸等等的不产品,主要应用于细胞培养领域的无血清培养基中。盐析法因生产周期长,纯度低和产品聚合体高、稳定性低等缺陷已很少应用。
目前国内应用比较普遍的是热变性法,结合较先进的超滤生产工艺,其工艺要求相对较低,制备成本低,其缺点是目前应用领域比较单一,仅供免疫诊断试剂使用。
我委组织对现行有效的卫生健康标准进行了复审。根据复审结论,《血清载脂蛋白A1及载脂蛋白B免疫透射比浊测定法》(WS/T121-1999)等17项标准自本通告发布之日废止。特此通告。附件:废止标准目录国......
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