固相溶血试验

实验概要

本文以鼻疽为例介绍了固相溶血试验(solid phasehemolysis test，SPHLT)的原理及操作流程。

实验原理

固相溶血试验是借鉴了单扩散溶血试验(single  radial hemolysis  test，或称被动溶血技术)而建立的一项血清学新技术。在红细胞表面吸附上抗原，与同种抗体作用形成抗原抗体复合物，在补体存在的条件下，通过传统途径激活补体，可以使红细胞发生溶血。如果加入的抗体与吸附在红细胞表面的抗原不相对应，则不能激活补体，也就不能发生溶血。试验中，可根据反应孔周围出现的溶血环直径大小，进行结果判定。

主要试剂

1. 鼻疽抗原、鼻疽阳性及阴性血清、冻干补体鼻疽抗原作1∶5、鼻疽阳性及阴性血清作1∶2、冻干补体作1∶3稀释；

2. 1/2万的鞣酸液；

3. 绵羊红细胞；

4. 1%琼脂糖凝胶。

实验步骤

1.  绵羊红细胞鞣酸化：绵羊红细胞用pH值7.2 PBS连续洗3次，每次均为3 000 r/min  3min。取洗过的压积红细胞0.4ml，加入pH值7.2 PBS  16ml，制成20%绵羊细胞悬液，使与1∶2万鞣酸液等量混合，置37℃水浴槽中感作15min，再以pH值7.2 PBS洗3次。

2. 绵羊红细胞致敏：取压积的鞣酸化红细胞与用pH值6.4 PBS配制的鼻疽抗原等量混合，置37℃水浴槽中感作30min，然后用pH值7.2 PBS洗3次。

3. 凝胶盘制备：取抗原致敏的压积红细胞33ml，加往融化后冷至55℃1%琼脂糖凝胶100ml中混匀，浇入塑料反应盘中，每盘约25ml。凝固后，以直径6mm打孔器在反应盘上打孔两列，每列5孔。

4. 加入要素及感作：将鼻疽血清和补体等量混合，以微量滴管加入到致敏红细胞琼脂糖凝胶反应盘的孔中，每孔0.025ml；然后置室温下作用3～4h后进行结果判定。

注意事项

1. 补体浓度对SPHLT发生溶血反应的性质有一定影响。补体浓度过高，可单独引起轻度溶血，检测阴性血清时，能出现弱溶血反应；若浓度过低，虽为阳性血清，也不能引起足够强度的溶血反应，易造成假阴性；应用1∶3倍左右的补体则不致造成检测误差。

2. 血清抗体的含量与SPHLT产生的溶血环的直径成正比关系。稀释度降低，则溶血环直径增大，反之则减小，为使各种强度的阳性血清均可被检出，又不与其他血清发生非特异性的交叉反应，采用1∶2被检血清为适当。

3. 抗原对SPHLT引起的溶血强度，随抗原浓度而变化，浓度高者，引起溶血反应强，反之则降低。实施反应时以1∶5为适宜。

4. 实施反应时，在15～29℃与4℃下感作，出现的溶血反应强度基本相同，而且于第3～4h即可看到明显的溶血现象，于第12h稍微增加，延长感作时间，溶血强度也不再增加。因此于第3～4h即可终判。在37℃恒温箱中感作，溶血现象不明显，不宜采用这种温度感作。

5. 对稀释液的要求不甚严格，可用生理盐水代替PBS，不影响实验结果。

6. 因为一般琼脂中含有抗补体物质，琼脂胶又能在一定程度上阻碍血清的扩散。因此用琼脂糖较为合适。

7. 在制备反应盘及打孔中的注意事项与固相补体结合反应相同。