qpcr原理及应用

一、原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

1、 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；

重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

二、应用

1、基因表达分析：例如结核分岔杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种生长相当缓慢的细菌，传统培养及鉴定一般需要花数周时间。

2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64，直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌，分析715个检体657个病人，其检测灵敏度（sensitivity）及特异性（specificity）分别为90.3%及98.6%。

整个实验流程可以在5个小时内完成，此方法可以用于没有套装试剂（kit）可以使用的实验室。

2、检验生物芯片的结果；

3、siRNA与miRNA诊断；

4、基因型鉴定；

5、饮食分析；

6、兽医微生物检测。

特点

1、荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；

其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。

2、每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环数称为CT(Threshold Cycle)，Ct值与起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，达到阈值的循环数就越少，换句话说CT值会越小。

如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以Ct值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。