qpcr实验流程

Q-PCR 实验流程

一、实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开 15-20 分钟。2超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA 抽提需 带口罩。

3取 EP 管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完 EP 管/枪头后，袋子及时封好。@橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程 中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。

G实验进行的过程中或观看实验时没有带口罩不要在超净台前讲话。

二、总 RNA 抽提

1)细胞培养皿中细胞样品用 1*PBS 洗两次后，用1m 枪将 PBS 吸净，加入lml Trizol(invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置 5min;

组织样品用液氮充分研磨，加入 1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min 使其充分裂解:(管盖与管壁都需标记样品名称)。

2)加入 200!1氯仿，剧烈振荡混匀 30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，

与第一步的顺序一致)

3) 4C下，14,000g 离心 15min，可见分为三层，RNA 在上层水相，移至另一个新的 RNase free EP 管:(用 20-200ul 的枪吸取上清，吸清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)。

三、去基因组

使用 RNase-free的DNase I(Promega)，按以下体系配置反应液，37C消化30min，65C灭活10min。