深圳先进院开发出合成生物学关键核心平台性技术

论文截图

合成生物学研究就像“造汽车”，通过将各类生物“零部件”设计与组装来构建人工生物系统。生物元件作为“汽车”的基本“零部件”，它的数量和功能制约着合成生物学的发展。针对合成生物学元件匮乏这一关键问题，定向进化能够利用进化这个“上帝之手”的力量对已有生物元件进行改造和优化，使研究者获得所需的“定制化功能”，是合成生物学领域的关键核心平台性技术。

中国科学院深圳先进技术研究院刘陈立与傅雄飞团队基于对微生物在空间上生长迁徙的定量理解，开发了一种连续定向进化系统（简称SPACE），形成了简便、高效、大规模定制生物元件的平台性能力。SPACE系统利用每个普通实验室都有的小小“平板”，将建库和筛选生物元件两个步骤结合在一起，从而实现实验装置的高度简化，成百上千的定向进化实验可以平行进行，一天时间就可以完成几十轮的进化。上述成果于9月21日在国际学术期刊Molecular Systems Biology上发表。

开辟连续定向进化的“创新”路径

传统的定向进化方法一般分为建库和筛选两个步骤，多轮进化往往需要进行大量的重复操作，耗费人力物力。2011年美国哈佛大学开发了噬菌体辅助连续进化系统（简称PACE），是定向进化领域一个重大突破。该方法能够使蛋白质在24小时内进化60轮，效率是传统实验室进化方法的100倍左右，并且整个实验过程无需人为干预，大大节省了技术人员的劳动成本。目前，该系统已被广泛应用于RNA聚合酶、TALEN、Cas9、碱基编辑器等重要酶类的进化改造。

然而，如果要同时进化多个目标蛋白，目前还缺少一种简便的定向进化技术/方法；另一方面，PACE系统需要连续培养装置（恒化器，chemostat）、复杂的流速控制与检测设备和一定的操作技巧，因此普通实验室不太容易开展PACE实验。

通过借鉴PACE系统中的相关设计，研究团队将空间尺度引入到了连续进化系统中，建立了空间噬菌体辅助连续进化（Spatial phage-assisted continuous evolution, SPACE）系统。该系统不仅大大提升了系统操作的简便性及元件突变体的筛选效率，为连续定向进化开辟创新路径，还具备了合成生物学领域内元件开发优化的巨大平台型技术优势，将为工业、农业、医学等各方面提供突破性技术助力。

解析空间进化规律 开发SPACE系统

此前，刘陈立团队在细菌迁徙定植研究中取得了重大突破。研究团队经过5年时间的大量实验反复研究细菌空间迁徙与进化过程，揭示了物种空间定植的进化稳定性策略及定量规律，为定量合成生物学、生态学等提供了全新的理论指导和启示。相关成果于2019年发表于《自然》。

“源于细菌迁徙定植的研究灵感，我们发现不同的突变体在群体迁移的过程中会相互竞争优势空间，最终使它们占据了空间上的不同位置，从而实现了不同突变体在空间上的分离”，论文通讯作者刘陈立介绍，目前的连续定向进化方法都采用均匀混合的液体体系，对有益突变体的筛选只能通过依赖其生长能力的优势，经过一定时间段的积累，使其获得在群体中的主导地位。

是否能让不同的突变体之间自发分离，使筛选过程变得更容易？

SPACE系统在PACE系统基础上，利用细菌-噬菌体共迁移实验体系，使原本没有运动能力的噬菌体能够被处于空间扩张运动过程中的细菌携带，并广泛传播。该共迁移实验体系与连续培养系统的相似性，将原本体积庞大且需要较复杂控制的液体连续培养装置替换成了普通生物实验室中最为常见的软琼脂平板。

“我们首先基于经典的传染病模型建立了空间扩张系统的宿主感染模型，定量解析了细菌-噬菌体共迁移实验体系的进化动力学规律，发现了不同强度的噬菌体突变体能够在空间上出现自发的分离。基于这个定量发现，我们设计开发了SPACE系统。”论文通讯作者傅雄飞介绍道。

也就是在这样一块小小的平板上，SPACE系统能够利用突变体之间对优势空间的竞争，实现不同强度突变体之间自发的分离，从而能比均匀混合的液体系统更高效地完成筛选过程。与此同时，进化的成功与否能够直接通过布满平板表面的细菌表层上肉眼可见的噬菌体感染区域的大小来进行判断，无需借助其他荧光或化学发光等指示信号的检测设备。

在空间系统中如何实现对噬菌体感染动态过程的控制、以及对进化初始条件的选择是研究过程中的较大难点。相较于研究团队前期建立的细菌空间扩展系统，噬菌体的加入使实验体系变得更加复杂。在缺乏理论指导的情况下，实验结果可能由于初始条件的细微变化而产生较大差异，导致进化不能向着需要的方向进行。

为了解决这一问题，研究团队根据丝状噬菌体慢性感染的特性，提出了区别于其他团队所提出的基于烈性噬菌体感染模型的新模型。并通过对噬菌体感染过程中噬菌体自身的复制动态、对宿主细菌生长的影响、以及噬菌体感染区域面积变化等过程进行大量的定量实验，测定出其中的关键参数用于完善模型。

由此建立的定量理论模型，能够用于预测在采用初始不同强度的基因元件时系统能够产生的效果，辅助系统中基因线路的设计。

小小“平板”让生物元件进化更快更高效

为验证SPACE系统的有效性，研究团队利用SPACE系统进行了多组并列进化实验。经过定量实验表征，得到了相比于原始聚合酶，识别目标启动子能力最高可达原来的900倍以上的突变体。通过同时进行的大量进化实验，也让研究团队获得了一个已定量表征活性的聚合酶突变体库，从中能够得到聚合酶不同的基因突变信息和活性变化数据，这将为后续聚合酶序列-功能相关的机理研究提供重要的依据。

图说：空间噬菌体辅助连续进化系统（SPACE系统）的应用展望示意图 来源：研究团队供图

在已有连续定向进化方法的基础上，该项研究通过实验与模型模拟相结合的方式定量揭示了宿主细菌的空间迁移运动能力对噬菌体进化的作用规律，在此基础上利用空间维度发展了蛋白质等生物分子的新型连续定向进化方法，是定量合成生物学全新研究范式的重要范例。

当前，可用的生物元件匮乏成为了合成生物学研究中亟待解决的关键问题，SPACE系统可以在普通实验室中实现生物元件的大规模平行进化改造，有望为合成生物学在化工、农业、医疗等领域的应用提供丰富的元件库储备。同时，细菌空间迁移运动对噬菌体进化的作用规律，也将对于研究更高等的生物，如昆虫、鸟类的迁徙对其携带的可能影响人类健康的病毒如何进化这类生态学理论或调查研究，提供参考和示范。