斯坦福团队证明，长读长如何诊断结构变异引起的疾病

一项最近发表的研究显示，长读长测序可以帮助诊断结构变异引起的罕见病，而这些变异难以通过短读长来鉴定。

斯坦福大学临床基因组学服务的研究人员上个月在刊前版服务器（Pre-print Server）bioRxiv上报道称，他们利用Pacific Biosciences的Sequel仪器来测序一名身患未知疾病的个体的全基因组，并找到了致病突变，而之前利用短读长测序技术漏掉了这个突变。

这项研究的资深作者Euan Ashley在接受采访时表示，Sequel上的测序价格恰好是在“临床背景下认为使用此技术合情合理的点”。

Ashley是医学和遗传学的副教授，也是斯坦福临床基因组学服务的主任。他表示，团队目前正在Sequel系统上测序一些其他的病例。目前由PacBio对斯坦福的病例开展测序，但临床基因组学实验室也考虑购买自己的仪器。

对于第一个病例，Ashley表示团队鉴定了一名症状类似于Carney综合征的个体，这种疾病的特点是良性心脏肿瘤（粘液瘤）以及内分泌腺出现肿瘤的风险增加。这名患者在幼年时期饱受粘液瘤的折磨，但医生无法通过分子诊断确定Carney综合征。

PRKAR1A是这种疾病中最常突变的基因，不过单基因测序显示其为阴性，而Illumina HiSeq 2500上的全基因组测序结果也一样。Ashley表示，这名患者正在考虑心脏移植，但医生希望在手术之前确诊疾病。“我们不希望在移植后发现问题又来了，”他说。

于是，研究团队决定用Sequel进行长读长的全基因组测序，这将有助于鉴定结构变异。

测序的覆盖度为10倍，这个深度足以检出结构变异，但又不至于太过昂贵。由于之前已开展过短读长测序，研究人员这次的重点就在缺失和插入，而不是SNV。初次分析鉴定出近7,000个缺失和插入。之后，研究人员利用各种过滤程序来缩小范围，排除对照个体中的变异，然后将重点放在与在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）有重叠的变异。过滤程序将范围缩小至三个缺失和三个插入，它们经过人工审核。

在这六个变异中，有一个是PRKAR1A基因的杂合缺失，它经过Sanger测序的证实。

Ashley表示，这个案例表明，利用长读长测序有望提高目前的临床测序流程的诊断率，在过去几年，这个诊断率一直在25%和35%之间徘徊。长读长测序有望将其大大提升，因为它能够更好地鉴定结构变异；然而，他也指出，在每个病例上常规使用，并达到鉴定SNV的测序深度，还是太贵了。在Sequel上进行10倍覆盖度的测序，费用大约为5000美元。他表示，这个价格点和覆盖度水平可实现特定病例的结构变异鉴定。

“我们还没有做好常规应用的准备，”他说，不过“我们有意将长读长测序引入我们的临床基因组学服务实验室，应用在那些我们强烈怀疑结构变异在疾病中起重要作用的病例上，”比如神经发育疾病和癌症。

“渐渐地，我们希望通过多重策略为我们提供最好的结果，”他说。尽管Sequel上的测序仍然比短读长测序更贵，但真正的问题是：诊断的成本是什么？“如果没有找到答案，短读长基因组再便宜也没用，”Ashley谈到。

Sequel上的全基因组测序也显示了短读长测序技术漏掉结构变异的程度。他表示，所鉴定的结构变异的绝对数量和数据库中未注释的结构变异数量显示了这种差异。幸运的是，在这种情况下，过滤策略是直截了当的，因为著名的基因存在一个变异，但这不可能发生在每个病例上，Ashley说。

此外，他表示，研究人员还没有仔细研究与OMIM数据库相关联的另外五个结构变异。随着越来越多的基因组用长读长测序，更多未知的结构变异将被鉴定出。“我们必须获得更多的群体数据，才能让我们得到查看这些变异所需的背景，”他说。