制备DNA测序模板实验——小量裂解物中制备λ噬菌体DNA

重组λ噬菌体

DNA酶ⅠRNA酶ⅠPEGSMSDSEDTA异丙醇乙酸钠TE

巴斯德吸管试管离心机

1.  在新鲜配制的λ顶层琼脂糖和λ琼脂糖平板上，通过在平板上裂解适于λ噬菌体生长的大肠杆菌菌株，制备重组λ噬菌体毒种原液。

2.  取700 μl 毒种液加入无菌的1.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的DNA酶Ⅰ及1 μl 1 mg/ml 热处理过的RNA酶A，于37℃温育30 min。

3.  加入700 μl λPEG溶液，冰浴放置1 h。

4.  4℃高速离心10 min，弃上清。再于4℃高速离心2 min，用拉细了的巴斯德吸管吸去残余上清。

5.  重悬噬菌体沉淀于500 μl SM 培养液，加入55 μl 10%SDS，0.5 μl 0.5 mol/l EDTA，轻轻混匀，于65 ℃保温15 min，不时轻轻摇匀溶解所有沉淀物。

6.  加入缓冲液平衡酚，用旋涡混合器剧烈振荡来抽提。

7.  室温高速离心2 min 将上层水相移入一个干净微量离心管中，重复用500 μl 1：1酚/氯仿抽提，再重复用500 μl 氯仿抽提。

8.  加入50 μl 3 mol/l pH7.0乙酸钠缓冲液，随后加入550 μl 异丙醇，于-20℃冰冻30 min。

9.  于4 ℃高速离心15 min，吸出并弃上清，晾干DNA沉淀。

10.  重悬沉淀于50 μl pH8.0的TE缓冲液。

11.  用于测序时，在碱溶液中变性0.1~0.3 pmol DNA（2~4 μg）。