单细胞的可靠全基因组扩增

目前多种新型分析技术，如新一代测序和芯片，都是为细胞群体而设计的，需要一定的样本量。对于一些临床或法医样本，如肿瘤细胞或循环胎儿细胞等，它们的细胞数量有限，直接限制了其下游应用。例如，在分析肿瘤细胞中的体细胞DNA突变或单个细菌基因组时，单细胞中的DNA无法满足测序的mg级样品量需求。为了从少量样品中获得更多信息，全基因组扩增技术（WGA）应运而生。

全基因组扩增的目的是在没有序列偏向性的前提下大幅增加DNA的总量。之前常用的技术有DOP-PCR和PEP-PCR等。然而，这些基于PCR的方法会产生非特异的扩增假象，影响实验结果。为此，QIAGEN推出了全基因组扩增产品REPLI-g Single Cell Kit，让研究人员在使用测序和芯片平台时能获得值得信赖的结果。

REPLI-g Single Cell Kit能够从单细胞（如分离的肿瘤细胞或细菌）中获得高产量的扩增DNA。它可用在广泛的应用中，使用各种临床和非临床研究样品，包括已纯化的基因组DNA（gDNA）、新鲜或干燥的血液，以及新鲜或冷冻的组织（表1）。REPLI-g Single Cell扩增后的DNA产物平均长度> 10 kb，且完整覆盖基因组，高度适合也已经开发用于新一代测序（NGS）、芯片法比较基因组杂交（array CGH）或qPCR分析（表2）。

新加坡基因组研究院的副研究员Masafumi Muratani博士已经试过了这个试剂盒，并成功开展了单细胞全基因组扩增。他表示：“获得的DNA让我能可靠检测一个结肠直肠癌细胞系中等位基因特异的点突变。扩增后DNA的出色产量和序列代表性确实帮助我推进了单细胞基因组学的研究工作。”

表1. 样品材料和研究领域的范围

样品材料（细胞/DNA）

研究领域

人/动物

生物标志物研究（SNP、突变、CNV）

干细胞研究

循环胎儿细胞的分析

嵌合研究

遗传易感性研究

转基因动物的分型

癌症

体细胞遗传变异分析

肿瘤发展

肿瘤干细胞/进化

循环肿瘤细胞的分析

细菌

宏基因组学研究

病原体分析

微生物基因分型

植物*

气孔研究

花粉分析

* 无细胞壁的细胞或已纯化的基因组DNA。

表2. 下游应用及仪器

应用

研究领域

全基因组测序

外显子组测序

新一代测序平台

SNP基因分型芯片

Array CGH

芯片平台

qPCR/PCR技术

实时定量PCR/PCR循环仪

Sanger测序

毛细管测序仪

焦磷酸测序

PyroMark®（QIAGEN）

原理

REPLI-g Single Cell Kit包含了REPLI-g sc聚合酶。它是高保真Phi 29聚合酶的优化配方，具有强的置换活性，可通过多重置换扩增（MDA）扩增复杂的基因组DNA，而温和的碱变性步骤可防止DNA片段化并产生脱碱基位点。Phi 29聚合酶确保了基因座的均匀扩增，它最多能复制70 kb而不与基因组DNA模板解离，实现了基因座的均匀扩增。与基于PCR的WGA技术不同，Phi 29聚合酶有着3’→5’的核酸外切酶校正活性，在复制时其保真度比Taq DNA聚合酶高出1000倍。

多重置换扩增（MDA）技术的过程如下：引物（箭头所示）与模板DNA退火，并利用在DNA模板链上移动的Phi 29聚合酶在30°C延伸，取代互补链，同时自身成为复制的模板。与PCR扩增不同，MDA不需要不同的温度，且最终的片段非常长，突变率低。

REPLI-g Single Cell Kit使用专门的缓冲液和试剂，反应设置简单，且处理时间仅为15分钟，能够为单细胞、有限的组织材料和已纯化的DNA带来高纯的全基因组扩增DNA，且序列代表性和无偏向扩增最大化。这些独特的组分，以及创新且标准化的UV处理步骤，能够消除任何可检测到的残留污染DNA，确保仅来自单细胞的高质量结果。

REPLI-g Single Cell Kit提供了：

• 单细胞材料的全基因组扩增，且基因组覆盖最大化
• MDA技术带来的基因座的无偏向扩增
• 经优化可用于新一代测序等新技术
• 高达40 μg的一致产量（产物平均长度 > 10 kb）
• 一种创新的工具（适合癌症研究和宏基因组学）

 

版权所有，未经书面许可，不得转载