原核表达之目的基因克隆

1. 了解实验课题对目的蛋白的要求

包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。

还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5位或3位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。

稀有密码子预测网址：

http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html

http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm

http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/

http://www.doe-mbi.ucla.edu/~sumchan/caltor.html

原核表达蛋白可溶性预测网址：

http://www.biotech.ou.edu/

综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌。

注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。

一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。

2. 搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；

注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N端还是在C端，若要在C端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；

1，2步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。

3. 摇菌，进行RNA抽提（注意选取不同表现型的菌株），摇菌的时间一定不要太长，太长的话RNA活性不高；

4. mRNA反转成cDNA（此步应在第三步完成后立即操作，RNA存放时间长易降解）；

5. 以cDNA为模板，利于设计好的引物进行PCR扩增；

6. 通过胶回收试剂盒回收目的DNA片段。