反常规！丙烯酰基修饰后酶活与细胞毒竟然完全相反

　　在众多药物分子中，有一类特别的分子，他们具有丙烯酰官能团，其作用特点是通过michael加成反应与目标蛋白形成共价键。曾经，由于副作用较大，这一类分子并不被药物开发业内认可。但近年来，随着靶向治疗技术的发展，研究人员发现可以寻找副作用和疗效之间的平衡点，从而更好的利用这一类药物分子。其中，开发成功的两个典型例子就是已经获得FDA批准上市的阿法替尼（afatinib）和依鲁替尼（ibrutinib），如图一所示，这两个药物分子都具有丙烯酰基。

图一 阿法替尼（afatinib）和依鲁替尼（ibrutinib）结构式

　　吉非替尼（gefitinb）是第一代表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂，主要用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。由于使用中逐渐出现的耐药性问题，目前，研究人员已经开发出第四代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），成功使患者的生存率得到提升。但在肺癌的治疗过程中，有近50%的患者会发生中枢神经系统转移，目前尚未有药物可以成功解决这一问题。其主要的挑战在于药物难以透过血脑屏障。阿斯利康开发的AZD3759在一定程度上可以克服这一挑战，但也尚处于临床I期阶段。

　　水溶性差和亲脂性高是阻碍药物吸收的主要影响因素，会增加药物的肝微粒体清除，以及增加药物的毒、副作用。因此，在不影响药物疗效的前体下提高化合物的细胞通透性和溶解度也是药物开发中的一大挑战。一般地，研究人员会通过在分子中引入甲基、苯基、哌嗪、吗啉、糖和氨基酸等官能团来优化药物分子溶解性及渗透性。

　　Log P是评价分子亲酯性的重要参数。一般地，潜在的药物分子，其cLog P应在0-5之间。当这个值大于5时，则难以穿透细胞膜，药动学性质较差。理想可以透过血脑屏障的候选药物分子cLog P为2-3（现有血脑屏障穿透性药物的cLog P在2左右）。但现有大多数药物分子（超过50%）的cLog P在4.25以上，也就是说，如果要让这些药物成功透过血脑屏障，就要降低这些药物分子的cLog P。目前，一般通过在这些分子上引入碱性基团来降低这些药物cLog P，但这种方法往往会增加药物分子的氢键作用，这不利于透过血脑屏障。

　　一般来说，研究人员需要平衡考量分子活性与亲酯性才能找到具有合理疗效和药动学性质的候选药物分子。阿法替尼（afatinib）与EGFR酶的相互作用已有报道，阿法替尼（afatinib）6位的丙烯酰基会与EGFR酶的cys797形成共价键。用甲基取代4位的氢原子，药物分子的活性会降低，因此认为，4位的N-H基团会与EGFR酶的活性位点形成氢键。

　　在新的研究中，研究人员选择了EGFR抑制剂吉非替尼（gefitinb）和AZD3759（2）作为先导化合物，因为这两个分子与相应活性位点的相互作用研究已经相对成熟。如图二所示，研究人员在4-苯胺喹唑啉上引入丙烯酰基，以此研究吉非替尼（gefitinb）和AZD3759两个化合物的丙烯酰胺衍生物的相应性质。基于之前的研究，研究人员推断4-苯胺喹唑啉上4位上的丙烯酰基并不会与EGFR酶形成共价键，因为从结合上来看，丙烯酰基与EGFR酶的cys797残疾距离较远，但研究人员认为这或许可以为先导化合物提供更好的物理化学性质（溶解性、亲酯性等）。

图二 新型EGFR抑制剂的设计

　　由此，研究人员根据图三所示路线合成了6a-6l，7等丙烯酰胺衍生物。

图三 丙烯酰胺衍生物的合成

　　随后，研究人员对这些化合物进行了构效关系研究（EGFR酶动力学分析）（表一）。结果发现， 丙烯酰修饰的衍生物对EGFR的体外酶抑制活性均不及未修饰先导化合物，例如1与6a，5f与6f，5g与6g，2与7。

表一 构效关系研究

　　但让研究人员感到意外的是，这些化合物针对A549细胞的体外细胞抑制活性分析却表现出了完全相反的活性（表二）。包括1与6a，5f与6f，5g与6g，2与7的细胞抑制活性，均与酶活测试结果相反。

表二 体外细胞抑制活性分析（A549细胞）

　　研究人员推断，造成酶活测试结果与体外细胞抑制活性分析相反的原因在于丙烯酰基改善了这些分子的理化性质。实验结果也证实，丙烯酰基修饰后，分子的稳定性提高，亲酯性下降，以及半衰期得到延长。

图四 理化性质分析

　　总的来说，新的研究证实了丙烯酰基修饰在药物研发中新的重要应用方向，即用于改善先导分子的理化性质，以此取得更好的药动药效学数据。这一研究对后续药物开发具有较大的指导意义。