哪些原因会导致液相色谱峰分离度差，峰分不开？

　　在液相色谱分析中，我们经常会遇到两个化合物无法得到基线分离或分离度差。液相色谱中流动相条件，色谱柱选择以及系统硬件的设置都会影响分离度。我们可以从以下几个方面考虑：

　　1.流动相

　　a. 流动相中有机溶剂的类型和比例，会影响色谱分离的选择性。对于反相色谱模式，常用的有机溶剂有甲醇、乙腈和四氢呋喃。我们可以通过改变流动相中的有机相种类或调整其比例，来改变选择性和分离度。

　　b.流动相的pH值和缓冲盐的添加也会影响分离度。对于中性的化合物，无论是极性还是非极性的，流动相pH值的改变不会对其选择性有太大的影响；对于可解离的化合物，pH的改变会产生较大的影响。对于酸性化合物，比如苯甲酸，其pKa为4.2，当流动相pH值大于5.7（pKa+1.5），则苯甲酸以离子型态存在，则与反相固定相之间的作用较弱，保留时间较短，当流动相pH值小于2.7 （pKa−1.5），则苯甲酸以分子形态存在，则与反相固定相之间有更强的保留作用，保留时间更长。同样，对于碱性化合物，当流动相的pH≥（pKa+1.5），则化合物以分子形态存在，对于反相色谱柱保留较强，当流动相的pH≤（pKa−1.5），则化合物以离子形态存在，对于反相色谱柱保留较弱。我们也可以通过添加缓冲盐来调整流动相的离子强度，来改善目标化合物与固定相之间的保留。

　　2.固定相

　　固定相中键合相的类型，填料的孔径，封端类型以及色谱柱的粒径和尺寸都会影响色谱分离的结果。其中最主要的因素是键合相的选择。如果色谱分离结果差，除了优化流动相之外，我们可以考虑改变键合相。比如，当你采用C18固定相无法得到好的分离结果，可以考虑极性较强的C8固定相，或者选择性与其有较大差异的Bonus RP或苯基己基柱进行尝试。或者采用封端的色谱柱代替未封端的色谱柱，对于碱性化合物的分离会得到更优异的峰型，从而改善色谱分离的结果。另外减小色谱柱粒径或适当增加色谱柱的长度，也可以提高柱效，改善分离结果，比如可以采用小粒径1.8um填料ZORBAX RRHT或RRHD色谱柱，或者表面多空层薄壳型填料poroshell120色谱柱，通过提高柱效来改善分离度。

　　3.硬件系统

　　对硬件系统的一些参数进行调整，也可以在一定程度上改善色谱分离的结果。比如：采用较高的采样速率来减小色谱峰的峰宽而提高分离度；采用较小内径的管线和较小的流通池来减小扩散体积和延迟体积减小色谱峰的展宽；或者通过提高色谱柱的柱温来改善分离度。