| 实验材料 | L-多聚赖氨酸 I型胶原蛋白酶 HBSS DMEM FBS DMEM BS 单克隆抗体 第二抗体 Sprague-Dawley大鼠 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | Leibowitz L-15 培养液 70%乙醇 |
| 仪器、耗材 | 培养瓶 培养皿 盖玻片 Petri培养皿 15ml带盖聚丙烯锥形管 7号弯镊和直镊 带盖圆底聚苯乙稀管 弯解剖剪 手术刀 切除用的板和针 荧光激活细胞分选仪 |
| 实验步骤 | 准备分离的 OEC 悬液 1. 通过断头处死大鼠（Sprague-Dawley 大鼠：生后 6~8 d 。尽管能够从任何年龄大鼠分离 OEC，但是从新生大鼠获得的 OEC 比年龄大的大鼠多）。用 15~20 只大鼠取细胞，FACS （荧光激活细胞分选仪（FACS；B-D Biosciences）分选这些细胞需 2~3 h，分选得到的 OEC 足以覆盖 10~15 张盖玻片，每张盖玻片 10000 个细胞。 培养瓶、培养皿和盖玻片：用 13.3 mg/ml L-多聚赖氨酸预涂 (a)孵育 1~24 h； (b)用 D-PBSA 洗一下； (c)使用前晾干。 2. 将头背侧部分定于切除板上，用 70 % 乙醇喷洒头部。 3. 使用前将全部器械用 70 % 乙醇浸泡，然后摇晃器械，使其变干。 4. 用尖弯剪除去皮肤，然后作环形切口，除去颅盖，在鼻尖处显露脑和两个嗅球。  5. 用弯镊从脑轻轻取下嗅球，放入有一滴 L-15 (含有庆大霉素）的 Petri 培养皿。 6. 用无菌手术刀片将嗅球切成小块。 7. 将嗅球小块放入含有 1 ml 胶原蛋白酶储藏液和 1 ml L-15 的小瓶中。 8. 在 37°C 条件下，孵育嗅球小块 30~45 min 。 9. 将悬液离心（1000 r/min，5 min），然后吸去上清液。 10. 用 1 ml 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS 混悬嗅球组织。 11. 神经胶质细胞易受损伤。因此，须轻轻分散嗅球组织，以形成单细胞悬液, 注意不要产生气泡。通过 19 G 皮下注射针分散嗅球组织，然后通过 23G 皮下注射针分散。 12. 加入 5 ml 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS，将悬液离心（1000 r/min，10 min )。然后，吸去上清液，用 DMEM-FBS （DMEM （GIBCO），添加 5 % FBS）混悬细胞，细胞浓度为 5×106 个/ml。 用 FACS 分选 OFC 为了尽吋能从被分选的细胞中除去较多的 O4+ 少突胶质细胞，最好用半乳糖脑苷脂的第二抗体（抗鼠 IgM-荧光素和抗小鼠 IgG3-藻红蛋白（Southern Biotechnology Associates 或 Cambridge Biosciences））（anti-GalC) [ Ranscht et al.，1982；Barnett et al.，1993 ] 标记细胞，以辨別少突胶质细胞和 OEC。在这方面，可进行双色分选，用两种抗体标记的不需要的细胞可忽略。用 FACSVamage 分选 1 h 。 13. 分散组织后，将 5×106 个细胞放入 15 ml 离心管，用 500 μl O4 和 ami-GalC 抗体杂交瘤上清液的混合液混悬细胞，在 4°C 条件下孵育 30~45 min 。细胞总数将超过 5×106 个，故应准备足够的离心管。如果杂交瘤上清液不含有高浓度抗体，增加细胞数将导致 O4+ 细胞的百分比明显降低。类似分析也用于 anti-GalC 杂交瘤上清液。因此，使用前常需要通过 FACS 分析滴定抗体。 14. 用 DMEM-FBS 将细胞洗 2 次后，再用 500 μl 含有羊抗小鼠 IgM-荧光素（1：100） 和羊抗小鼠 IgG3-藻红蛋白（1：100）的 DMEM-FCS 混悬，在 4°C 条件下孵育 30 min。 15. 通过离心，用 15 ml DMEM-FBS 将细胞洗 2 次。然后，用冰冷的 DMEMFBS （DMEM (GIBCO ) ，添加下列成分（Bottenstein 和 Sato，1979)：25 mmol/L （4.5 g/L）葡萄糖、25 μg/ml 庆大霉素（Invitrogen）、0.0286% (V / V ) BSA pathocyte ( MP Biomedicals)、2 mmol/L 谷氨酸胺、10 μg/ml 牛膜岛素、100 μg/ml 人转铁蛋白、0.2 μmol/L 孕酮、0.10 μmol/L L-腐胺、0.45 μmol/L L-甲状腺素、0. 224 μmol/L 硒和 0.49 μmol/L 3，3， 5-L-三碘甲状腺原氨酸。除庆大霉素和 BSA pathocyte 外，其余试剂都是 Sigma 公司生产的）混悬分选管（2085，BD Biosciences）内的细胞，密度为 2×106 个/ml。将分选管放在冰上。当细胞放在冰上时，抗体标记细胞的 FACS 图像至少 3~4 h 内是稳定的。 16. 本操作步骤叙述 FACStar 细胞分选仪分选细胞的方法。然而，任何种类的细胞分选器应产生类似的结果。使激光排列成 488 nm 激发光线。须设定荧光补偿，以除去每种荧光源中的过剩荧光。在分选单独用第二抗体标记的细胞之前，应分析对照细胞，以便于解释非特异性标记和通过减少光倍增管的增益除去非特异性荧光。 17. 将细胞分选窗设置在 O4+ GalC－ 附近。O4+ 嗅球细胞的平均百分比应为 10% ± 1% 。 18. 将 O4+ GalC－ 细胞分选入含有 4 ml DMEM-FBS 的圆底聚苯乙烯筲。 19. 分选后，将分选的细胞移入 15 ml 离心管。用培养液清洗分选管，将清洗液加入离心管，然后加入 DMEM-FBS。离心（100 g，15 min）。 20. 吸去上清液，用 DMEM/BS 混悬细胞。用 DMEM/BS：ACM（1：1）稀释时，可获得理想的 OEC 活力和生长 [ Barnett et al. ，1993 ] 。ACM 是用 DMEM/BS 培养 48 h 后从纯化的皮质星形胶质细胞单层 [ Noble and Murrey，1984 ] 收集的 。 |
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