培养细胞时到底要不要烧瓶口？

养细胞是医学研究生的基本功，每位初学者大多都会有一下三个疑惑：

1、养细胞时要不要烧瓶口？不烧的话污染了咋办？

答： 不要烧瓶口。大多数人都喜欢在酒精灯的火焰上关瓶子，觉得这样可以避免污染。不知道大家是不是有培养基怎么越用越发紫的困惑？知道为什么吗？烧瓶口烧的。培养基一般都是用碳酸 / 碳酸氢跟作缓冲体系。瓶口在火焰上的时候，炽热的空气进入瓶内。塞紧塞子放入冰箱后，空气变冷，压力骤降，培养基中的碳酸就会转化成二氧化碳，释放出来。培养基中的碳酸少了，当然会变碱。如果不烧瓶口的话，你会发现培养液变碱的速度会大大减慢。（当然多多少少还是会有一点越用越碱，因为室温还是比冰箱内的温度高）

@四眼看科学：不烧瓶口是对的，污染与否和操作习惯，无菌意识，环境清洁度密切相关的，做好手的消毒，不要让手或其他器壁碰到瓶口，换液时确保移液管、枪 头无菌，不要对着瓶口倒。

@panther75：如果大家习惯了烧瓶口，也未尝不可。只是培养液变碱了怎么办呢？有些人用稀盐酸或醋酸重新调 pH 值。这样做是不对的。因为虽然 pH 值暂时纠正了，但是培养基的缓冲能力也就没多少了。加了这样的培养液很快就会变黄。正确的做法是把装培养基的瓶口拧松，放到二氧化碳培养箱中，过夜。让培养箱中的二氧化碳进入培养基。pH 值就可以纠正回来。如果不想这么做，也可以在培养基中加 Hepes。Hepes 不会挥发，随你怎么烧瓶口，培养液的颜色都不会变。如果嫌加 Hepes 麻烦，把培养基分装到小瓶中也是个办法。让培养基开几次瓶就用完。也可以用培养皿养细胞。培养皿的开口比培养瓶大，二氧化碳容易进入。即使加的培养基很紫，放入培养箱后一会儿就能纠正成樱桃红。如果还是坚持用培养瓶，瓶口一定要拧得很松，要那种再拧一圈就要掉下来才行。

2. 隔多久看一次我的细胞？为啥我一天到晚都在看，细胞老是长不好？

答：不要频繁看细胞。对于初学者而言，养细胞就像养孩子一样，有空就要去看看。细胞越是养不好，就越是经常去看。实际上看细胞对细胞的生长没有任何好处，特别是对原代细胞或是免疫磁珠分选后，密度特别低的细胞。培养基中的生长因子是非常有限的。细胞好不容易自分泌一点儿促生长的因子在其周围，形成有利于生长的局部环境。你跑去看细胞，培养瓶这么一晃，把因子都给晃散了。

@summityoung：细胞状态不好的时候 2 天换一次液，适当提高血清浓度、有条件的用进口胎牛血清，几天之后细胞会慢慢长起来的。细胞稀疏以及状态不好的时候不要多看细胞，一天看一次够了，切忌不要多看。

@oursm：至于不要频繁看细胞，主要强调的还是刚开始培养的几天，也就是所谓的细胞生长的「滞留期」，一旦进入对数期，当然应该及时观察细胞形态。

3. 什么时候中止消化？

答：不要怕消化。在传代的时候，初学者往往生怕细胞消化过度，早早地终止消化。细胞没下来就使劲吹灯，吹得满瓶子都是气泡。在我看来，用力吹打对细胞的损伤比消化更大。我师兄在做血管平滑肌原代的时候，37 度消化过夜，细胞也没事。我一般是等细胞完全变圆后才中止消化。细胞轻轻一晃就能下来。还有，动作要轻柔，尽量不要产生气泡。气泡在破裂时的机械应力相当大，对细胞的伤害也是很大的。