多色流式细胞术分析细胞内特定的细胞类型

多色流式细胞术是一种强大的技术，用于分析细胞内特定的细胞类型中表达的蛋白质。对于许多类型的细胞，如Th17细胞，细胞表面和细胞内标记物的结合使用是必要的明确的表型鉴定。表征信号响应于特定的靶细胞的性质，可用于表面标志物的同时分析和信号转导蛋白。

　　细胞表面染色的技术是比较标准的，往往依赖于目标蛋白的生物学细胞内标记物的染色。根据在细胞内的蛋白质的位置，与其他分子，它的稳定性，不同的细胞制备和染色方法的建议。细胞因子，例如，典型的分泌蛋白。但是，如果它们在细胞内被困住的，它们可以被污染：BD GolgiStop的?（含莫能菌素）或BD GolgiPlug的?（含布雷菲德菌素甲）如使用蛋白转运抑制剂作为细胞内蛋白质。细胞因子是相对使用的温柔固定和通透赋予由BD Cytofix / Cytoperm?固定和透化解决方案访问。

　　相反，细胞因子，转录因子通常被定位在细胞核内DNA和其他蛋白质结合。一些蛋白质的磷酸化，如Stat5的，导致二聚体的形成，还掩盖了磷酸化的表位。此外，细胞内磷酸酶可以快速去磷酸化蛋白。因此，处理后的细胞，必须迅速地固定，并进行更强的通透条件允许抗体进入细胞核并进入破坏的分子复合物的抗原表位内。

　　所用的透化技术产生负面影响的细胞表面和其他细胞内抗原的检测。允许进入细胞核，并打开DNA /蛋白质或蛋白质/蛋白质复合物的相同的技术往往能细胞表面抗原变性，防止其被抗体的检测。虽然不同的细胞内蛋白质的检测可能需要不同的条件，基本原则是相同的：细胞是固定的，通透的，然后用荧光抗体染色细胞。

　　细胞内染色的基本原则细胞固定和通透（象征虚线膜），染色，然后用流式细胞仪分析。对于分泌的蛋白质的研究中，细胞首先与一种蛋白转运抑制剂治疗的目标蛋白在细胞内的积累，以允许..

　　胞内流式细胞仪BD工具为了促进BD流式细胞仪检测细胞内，已经开发了几个包，缓冲区和协议。此外，许多关键的细胞表面标志的特定荧光抗体测试几个缓冲系统，以节省研究人员的时间，样品，和金钱。常用的为特定的应用程序的BD缓冲器包括：

　　检测细胞因子BD Cytofix / Cytoperm的固定/通透的解决方案（编号：554722）是适用于染色大多数细胞因子和细胞表面标志。该缓冲系统也可用于一些转录因子和其它细胞内蛋白染色。该缓冲系统包含温和的洗涤剂以及与甲醛固定液。

　　转录因子是专为BD Pharmingen公司的转录因子的缓冲液设置（部件号五十六万二千七百二十五分之五十六万二千五百七十四）单独或结合细胞表面标志物和细胞因子的转录因子染色。该缓冲系统包含温和的洗涤剂以及与甲醛固定液。

　　检测磷酸化蛋白的BD Phosflow?烫发缓冲III（货号：558050）推荐的通透缓冲通过流式细胞仪phosphoepitope检测。彼尔姆缓冲III是一个严酷的以酒精为基础的缓冲区。也可替代通透性缓冲区，以适应特定的实验要求。

　　优化细胞通透性条件不同表位的位置的通透条件决定的抗原表位的细胞内的无障碍。磷酸701表位（橙色）位于的STAT蛋白二聚体，而磷酸丝氨酸727表位是位于外二聚化地区。对于的磷酸701网站，如烫发缓冲III染色所需的更严厉的缓冲。以诱导蛋白的磷酸化，人外周血单核细胞（PBMCs）被留下未处理的（ - ）或（+）激活的人IFN-α（急性髓pY701）或PMA（急性髓pS727）。细胞被固定使用BD Cytofix?固定缓冲通透使用BD Phosflow?烫发缓冲区I，II，III，IV，染色前用荧光磷酸化抗体。