实时荧光定量RTPCR的Foldchange怎么计算

3. Real-time qPCR定量方法

可以分为绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是2-DDCt 。

3.1绝对定量

从标准曲线获得线性方程：

Y=-3.432X+34.638;R2= 0.995, E=95%，所以可以进行数据分析。

如果未知样品的 Ct=25，

代入方程： 25=-3.432X+34.638,

所以： X=2.8

Copies=10^2.8

3.22-DDCt定量

2-DDCt方法使用的前提是内参和目的基因的扩增效率接近100%，且相差不超过5%。所用公式如下：

2-DDCt=2-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]处理组-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]对照组

=2-[E-F]处理组-[A-B]对照组=2(F-B)-(E-A)

比如Cdk5在处理前和处理后样品中的Ct平均值是25和22.1；内参GAPDH在处理前和处理后样品中的Ct平均值是18.2和18.3.那么处理所致倍数变化(fold change)应该是

=2-[(22.1-18.3)]处理组-[(25-Ct18.2)]对照组=23=8

也就是处理造成Cdk5表达增加了7倍。

如果是目的基因和内参基因的扩增效率相差比较大，可以用扩增效率进行校正，也就是Pfaffl方法。所用公式如下：

处理所致倍数变化(fold change)= C(A-E)/D(F-B)

扩增效率（E）=10-1/斜率(理想的PCR扩增效率=2)

百分比表示为：e%=(E-1)×100%

同时是上面例子，如果Cdk5的扩增效率是70%；GAPDH的扩增效率是95%，那么处理所致的倍数变化（fold change）应该是

=（1.7）（25-22.1）/(1.95)(18.3-18.2)

=4.36

即处理造成Cdk5表达量增加了3.36倍。